《酶与催化反应》课件.ppt

第七章 酶与催化反应ENZYMES AND CATALYTIC REACTIONS,酶学研究简史,公元前两千多年，我国已有酿酒记载。1833年，Anselme Payen提纯了麦芽淀粉糖化酶（淀粉酶）。1878年，Wilhelm Khne首次提出enzyme一词。1894年，Emil Fischer证明了酶的专一性，酶与底物之间作用的锁钥关系。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten推导出酶反应的动力学方程式。19261930年，James Sumner和John H.Northrop分别将脲酶和胃蛋白酶、胰蛋白酶制成结晶，确定了酶的蛋白质本质。1941年，George Beadle和Edward Tatum的“一个基因一个酶”假说首次将蛋白质与基因联系在一起，推动了生物化学与遗传学的结合。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,第一节 酶和酶促反应 Enzymes and Enzymatic Reactions,一、化学反应具有热力学和动力学特性,（一）热力学性质涉及反应平衡和能量平衡,1反应平衡可用平衡常数来描述,一定的温度下，Keq与反应的初始浓度无关，它反映化学反应的本性。Keq越大则反应越倾向于产物的生成，即正向反应进行得越完全；Keq越小则逆反应的程度越大。Keq是化学反应可能进行的最大限度的量度。,2自由能的变化是化学反应的动力,反应物的自由能（G）与其焓、温度（T）和熵（S）相关，等于其焓减去绝对温度和熵的乘积，即G=H TS。,在生物系统中，生物分子在等温、等压条件下，在化学反应中能量的变化可以用自由能变（G）来量度。,G=H TS,自由能的变化是化学反应的动力，影响化学反应的方向。,反应方向与H、S和T的关系,3标准自由能变与平衡常数有关,标准自由能变（G）是指在标准状态下的自由能变,（二）动力学性质是对反应速率的描述,动力学是研究化学反应速率及其影响因素的科学。,反应速率是单位体积内反应进度随时间的变化率,任何反应速率均由底物浓度和速率常数（rate constant,k）所决定。,一级反应（first-order reaction）:单底物反应 二级反应（second-order reaction）：双底物反应,二、酶的化学本质是蛋白质,（一）单纯酶仅含有氨基酸组分,有些酶其分子结构仅由氨基酸残基组成，没有辅助因子。这类酶称为单纯酶（simple enzyme）。如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。,（二）结合酶既含有氨基酸组分又含有非氨基酸组分,结合酶（conjugated enzyme）是除了在其组成中含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分,辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）,一些化学稳定的小分子有机化合物是重要的辅酶或辅基。,辅酶在反应过程中可与多种酶蛋白结合，作为底物在不同的酶之间传递电子、质子或化学基团。,辅基在反应中不能离开与其结合的酶蛋白。,小分子有机化合物辅酶（辅基）的种类与作用,金属离子的作用：作为酶活性中心的组成部分参加催化反应，使底物与酶活性中心的必需基团形成正确的空间排列，有利于酶促反应的发生；作为连接酶与底物的桥梁，形成三元复合物；金属离子还可以中和电荷，减小静电斥力，有利于底物与酶的结合；金属离子与酶的结合还可以稳定酶的空间构象，稳定酶的活性中心。,金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。金属激活酶(metal-activated enzyme)金属离子为酶的活性所必需，却不与酶直接结合，而是通过底物相连接。,金属酶和金属激活酶,（三）单体酶仅含有一条肽链而寡聚酶含有两条或两条以上的肽链,三、按酶所催化反应的类型将酶分为六大类,（一）催化氧化还原反应的酶属于氧化还原酶类,氧化还原酶类（oxidoreductases）包括催化传递电子和氢、以及需氧参加反应的酶。例如，脱氢酶类、加氧酶类、过氧化物酶和过氧化氢酶等。,（二）催化分子间基团转移或交换的酶属于转移酶类,转移酶类（transferases）包括将磷酸基从ATP转到另外底物的激酶、加无机磷酸使化学键断裂的磷酸化酶，以及糖基转移酶、转氨酶等。,（三）催化底物发生水解反应的酶属于水解酶类,水解酶类（hydrolases）,按其所水解的底物不同,根据它们的作用部位,蛋白酶、酯酶、磷酸酶、糖苷酶、核酸酶,外切酶、内切酶,（四）催化从底物移去一个基团并形成双键的反应或其逆反应的酶属于裂合酶类,（五）催化同分异构体相互转化的酶类属于异构酶类,异构酶类（isomerases）：催化分子内部基团的位置互变、几何或光学异构体互变、以及醛酮互变的酶类。,如：变位酶、表构酶、异构酶。,（六）催化两种底物形成一种产物同时偶联有高能键的水解释能的酶属于合成酶类,DNA连接酶、氨基酰-rRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶属于连接酶或合成酶类。,合成酶类（synthetases）又称连接酶类（ligases）。,四、酶可按其所催化的反应类型予以命名,（一）酶的系统命名法可反映出酶的多种信息但比较繁琐,系统命名法根据酶所催化的整体反应，按酶的分类对酶命名，每个酶都有一个名称和一个编号。,编号中4个数字中第1个数字是酶的分类号，第2个数字代表在此类中的亚类，第3个数字表示亚-亚类，第4个数字表示该酶在亚-亚类中的序号。,酶的分类与命名举例,（二）推荐名称简便而常用,由于系统名称较烦琐，国际酶学委员会还同时为每一个酶从常用的习惯名称中挑选出一个推荐名称（recommended name）,系统名称 L-乳酸：NAD+氧化还原酶推荐名称 乳酸脱氢酶,五、同工酶催化相同的化学反应,（一）同工酶是催化相同化学反应而结构不同的一组酶,定义:同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。,同工酶主要由于基因倍增（duplication）和趋异（divergence）所致。,*举例：乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5),（二）同工酶在生物体中的表达分布具有时空特异性,同工酶存在于同一种属的不同个体，同一个体的不同组织、同一细胞的不同亚细胞结构，以及同一组织、细胞的不同发育阶段。,人体各组织器官LDH同工酶谱（活性%）,（三）检测组织器官同工酶谱的变化有重要的临床意义,在代谢调节上起着重要的作用；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,第二节 酶的工作原理Mechanism of Enzymatic Reactions,、酶具有与一般催化剂相似的工作原理,（一）酶与一般催化剂一样能降低反应的活化能,1活化能是化学反应的能障,活化能：指在一定温度下一摩尔底物（substrate）从低自由能的初始态转变成能量较高的过渡态所需要的自由能，即过渡态中间产物比基态底物高出的那部分能量。,酶和一般催化剂加速反应的机制都是降低反应的活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,2活化能的降低可使反应速率呈指数上升,（二）酶与一般催化剂一样能加速化学反应而不改变反应的平衡点,酶与一般催化剂一样，只能加快反应速率，使其缩短到达反应平衡的时间，而不能改变反应的平衡点。,反应达到平衡时自由能的变化仅取决于底物与产物的自由能之差。,任何催化剂都不能改变底物和产物自身的自由能。,二、酶具有不同于一般催化剂的显著特点,酶的催化效率通常比无催化剂时的自发反应高1081020倍，比一般无机催化剂高1071013倍。,（一）酶对底物具有极高的催化效率,酶的特异性或专一性（specificity）,酶对其所催化的底物和反应类型具有严格的选择性，一种酶只作用于一种化合物，或一类化学键，催化一定的化学反应并产生一定结构的产物的现象。,（二）酶对底物具有高度的特异性或专一性,1.有的酶对其底物具有极其严格的绝对专一性,有的酶仅对一种特定结构的底物起催化作用，产生具有特定结构的产物。酶对底物的这种极其严格的选择性称为绝对特异性（absolute specificity）。,脲酶仅水解尿素，对甲基尿素则无反应。,2.多数酶对其底物具有相对特异性,多数酶可对一类化合物或一种化学键起催化作用，这种对底物分子不太严格的选择性称为相对特异性（relative specificity）。,脂肪酶不仅水解脂肪，也可水解简单的酯。,胰蛋白酶水解由碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的羧基所形成的肽键。,各种蛋白酶对肽键的专一性,人体内有多种蛋白激酶，它们均催化底物蛋白质丝氨酸（或苏氨酸）残基上羟基的磷酸化,3.有些酶对其底物表现出立体异构专一性,酶对空间构型所具有的特异性要求称为空间异构特异性（stereospecificity）,延胡索酸酶仅对延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，将其加水生成苹果酸，对顺丁烯二酸则无作用,乳酸脱氢酶仅催化L-乳酸脱氢生成丙酮酸，而对D-乳酸无作用。,三、酶活性中心是酶与底物结合并将底物转化为产物的特定部位,（一）酶分子上的必需基团与酶的活性密切相关,溶菌酶的活性中心,酶的活性中心由许多必需基团组成,必需基团(essential group)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，与酶活性密切相关的化学基团。,活性中心内的必需基团,位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。,活性中心外的必需基团,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,目 录,组成酶活性中心的必需基团在一级结构上可能相距很远，但在形成三级结构时相互接近，形成具有三维结构的区域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。,（二）酶的活性中心的构象有利于酶与底物结合及催化反应,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶活性中心“口袋”,（一）酶与底物之间的相互作用表现有多种效应,1酶与底物结合时相互诱导发生构象改变,诱导契合假说（induced-fit hypothesis）,酶-底物复合物,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。,四、酶对底物具有多种催化机制,羧肽酶的诱导契合模式,2形成酶-底物过渡态复合物过程中释放结合能,底物与酶的活性中心相互诱导契合形成过渡态化合物，过渡态与酶的活性中心以次级键(氢键、离子键、疏水键)相结合，这一过程是释能反应，所释放的能量称为结合能(binding energy)。结合能可以抵消一部分活化能，是酶反应降低活化能的主要能量来源。酶不能使底物形成过渡态，则没有结合能的释放，也就不能催化反应的进行。,3邻近效应和定向排列有利于底物形成过渡态,邻近效应（proximity effect）和定向排列（orientation arrange）将分子间的反应变成类似分子内的反应，使反应速率显著提高。,在疏水环境中进行酶反应有很大的优越性，此现象称为表面效应（surface effect）。,酶的活性中心多位于其分子内部的疏水“口袋”中，酶反应在酶分子内部的疏水环境中进行。疏水环境可使底物分子脱溶剂化（desolvation），排除周围大量水分子对酶和底物分子中功能基团的干扰性吸引或排斥，防止二者之间形成水化膜，利于底物和酶分子之间的直接密切接触和相互结合。,4.表面效应有利于底物和酶的接触与结合,（二）酶对底物呈现多元催化,酶是两性解离的蛋白质，酶活性中心上有些基团是质子供体（酸），有些是质子接受体（碱）。,这些基团在酶活性中心的准确定位有利于质子的转移，这种一般酸-碱催化（general acid-base catalysis）可以使反应速率提高102105倍。,质子转移反应都包含一般酶-碱催化反应,酶分子中具有酸-碱催化作用的基团,酶可与底物形成瞬时共价键,很多酶在催化过程中，与底物形成瞬时共价键，底物与酶形成共价键后被激活，并很容易进一步水解形成产物和游离的酶。这种催化机制称为共价催化（covalent catalysis）。,AB+E：AE+BH2OAE A+E：+B,酶的亲核基团与底物共价结合,酶可通过亲核催化或亲电子催化加速反应,酶活性中心有的催化基团属于亲核基团，可以提供电子给带有部分正电荷的过渡态底物，形成瞬间共价键。这种催化作用称为亲核催化（nucleophilic catalysis）。,亲电子催化（electrophilic catalysis）可使酶活性中心的阳离子亲电子基团与富含电子的底物形成共价键。,胰凝乳蛋白酶的亲核催化、共价催化和酸-碱催化机制,第三节 酶促反应动力学The Kinetics of Enzymatic Reactions,概念研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。,研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,单底物、单产物反应；酶促反应速率（velocity，V）一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速率；底物浓度远远大于酶浓度。,研究前提,一、采用酶促反应初速率来研究酶促反应动力学,（一）酶活性是指酶催化化学反应的能力,衡量酶活性的尺度是酶促反应速率的大小。酶促反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。由于底物的消耗量不易测定，所以实际工作中经常是测定单位时间内产物的生成量。,酶的活性:以国际单位（international unit,IU）表示。在规定的实验条件下（如温度、pH的限定和足够的底物浓度等），每分钟催化1mol底物转变成产物所需要的酶量为1个国际单位（IU）。,催量（Katal）,1IU16.67109 Kat,1催量是指在特定条件下，每秒钟将1mol底物转化成产物所需的酶量,（二）酶促反应初速率是反应刚刚开始时测得的反应速率,酶促反应初速率是指反应刚刚开始，各种影响因素尚未发挥作用时的酶促反应速率，即反应时间进程曲线为直线部分时的反应速率。,（三）有三类方法可用来测定底物或产物的变化量,1直接测定法是对底物或产物量的变化进行直接检测,有些酶促反应可在反应进行一定时间后，不用任何辅助反应便可直接测定反应液中底物或产物的浓度。这类测定方法称为直接测定法（direct assay）。,还原型（Fe2+）细胞色素c在波长550nm处有明显的吸收峰，而氧化型（Fe3+）则无；细胞色素C氧化酶对细胞色素C的氧化反应，可以直接在波长550nm处检测一定时间内还原型细胞色素C的减少过程。,有些酶促反应的底物和产物不能直接进行检测，必须增加一些辅助试剂来达到检测的目的，这种方法称为间接测定法（indirect assay）,2间接测定法利用非酶辅助反应对底物或产物量的变化进行间接检测,3酶偶联测定法是间接反映初始反应的底物或产物量的变化量,许多酶促反应的底物和产物虽然不能直接检测，但可以与另外的酶反应相偶联，偶联的酶以第一个酶的产物为底物，或以此类推，以最后的酶反应产物可以直接检测为目的。这种通过偶联其他酶并对此酶促产物进行直接检测，间接地反映待测酶反应的底物或产物变化量的方法称为酶偶联测定法（enzyme coupled assay）,外加的酶称为工具酶或辅助酶（auxiliary enzyme）,产物可直接检测的酶称为指示酶（indicator enzyme）,丙氨酸转氨酶丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+谷氨酸乳酸脱氢酶丙酮酸+NADH+H+乳酸+NAD+（在340nm处有吸收峰）（在340nm处无吸收峰）,二、酶促反应速率受底物浓度的影响,（一）酶促反应速率对底物浓度作图呈矩形双曲线,在酶浓度和其他反应条件不变的情况下，反应速率V对底物浓度S作图呈矩形双曲线。,当底物浓度较低时,反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。,目 录,随着底物浓度的增高,反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。,目 录,当底物浓度高达一定程度,酶被底物所饱和，反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应。,目 录,（二）反应速率与底物浓度的关系可用米-曼氏方程式表示,1米-曼氏方程定量地描述底物浓度与反应速率的关系,1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximum velocity)m：米氏常数(Michaelis constant),米-曼氏方程式推导基于两个假设：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应。即 Vk3ES(1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。,2米-曼氏方程的推导过程引入了稳态概念,稳态：是指ES的生成速率与分解速率相等，即 ES恒定。k1(EtES)Sk2 ES+k3 ES,则(2)变为:(EtES)S Km ES,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EtES，反应达最大速率Vmaxk3ESk3Et(5),将(5)代入(4)得米氏方程式：,KmS,Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。,（三）动力学参数可用来比较酶促反应的动力学性质,1Km值等于即刻反应速率达到Vmax一半时的底物浓度,2Km是酶的特征性常数,在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改变而不同。,同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶对同一底物也有其各自的Km。,Km的范围多在10-610-2mol/L之间。,一些酶的底物的Km,3Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和力,当k3 k2时，Km k2/k1。即相当于ES分解为E+S 的解离常数（dissociation constant,Ks）。此时，Km代表酶对底物的亲和力。,Km越大，表示酶对底物的亲和力越小；Km越小，表示酶对底物的亲和力越大。,4Vmax是酶被底物完全饱和时的反应速率,当所有的酶均与底物形成ES时（即ES=Et），反应速率达到最大。即Vmax=k3 Et。,5kcat代表酶的转换数,kcat=Vmax/Et,kcat表示酶被底物完全饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物的分子数。,一些酶的转换数,6在低底物浓度时，kcat/Km代表酶的催化效率,kcat/Km是此二级反应的速率常数，也称特异性常数，其单位是L/(mol S)。,反应速率的大小取决于E和S由于相互渗透而相互碰撞的速率。.这种被渗透控制的碰撞速率(diffusion-controlled rate of encounter，DCRE)的上限是108 L/(mol S)。kcat/Km越接近此数据，酶的催化效率越高。,一些kcat/Km值接近DCRE的酶,（四）采用作图法可求得酶促反应的动力学参数,1林-贝氏作图法是求得 Vmax和Km的最常用方法,林-贝氏方程式（Lineweaver-Burk equation）,将米氏方程式两边取倒数，并加以整理，则得出米氏方程式的双倒数形式：,直线在纵轴的截距等于1/Vmax，而在横轴上的截距为1/Km,2其他一些作图法也可较准确地求得Vmax和Km,直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km,伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofstee plot）,米氏方程式两边均除以S,直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax,三、在一定条件下酶促反应速率与酶浓度呈正相关,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比关系式为：V=k3 E,A：底物浓度曲线，其中，E1 E2 E3。从图中可知，E的变化不影响酶促反应的Km。,B：反应速率对酶浓度作图，V与E呈直线关系。,四、酶促反应速率受反应系统温度的双重影响,双重影响温度升高，酶促反应速率升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速率降低。,最适温度(optimum temperature)酶促反应速率最快时的环境温度。,哺乳动物组织中酶的最适温度多在3540之间,Taq DNA聚合酶最适温度为72,*低温的应用,一般的酶在低温下活性降低，但酶本身不被破坏，其活性可随温度的回升而恢复,低温保存酶和菌种等生物制品,低温麻醉,五、酶促反应速率受反应体系pH的影响,最适pH(optimum pH)酶催化活性最大时的环境pH。,体内酶的最适pH多在6.58之间。,胃蛋白酶的最适pH为1.8,精氨酸酶的最适pH为9.8,pH对几种酶活性的影响,六、激活剂可加速酶促反应速率,必需激活剂（essential activator）为酶促反应所必需，如缺乏则测不到酶的活性,Mg2+为己糖激酶的必需激活剂,非必需激活剂（non-essential activator）可以提高酶的催化活性，但不是必需的,Cl-对唾液淀粉酶的激活作用,在酶促反应中，凡能与酶结合而使酶的催化活性下降或消失，但又不引起酶变性的物质称为酶的抑制剂（inhibitor，I）。,七、抑制剂对酶活性可表现出可逆或不可逆性抑制作用,抑制剂可与酶活性中心内或活性中心外的必需基团结合，从而抑制酶的活性。,根据抑制剂与酶是否共价结合及抑制效果的不同，将抑制剂对酶的抑制作用分为可逆性抑制剂（reversible inhibitor）和不可性逆抑制剂（irreversible inhibitor）。,可逆性抑制剂,一类抑制剂与酶的调节部位结合，使酶发生变构，从而对酶发挥抑制作用（别构抑制作用）。,一类抑制剂通过与游离酶或/和酶-底物复合物可逆地结合而影响酶的催化活性。,可逆性抑制作用的抑制剂可以与游离酶结合，形成二元复合物EI；也可以与ES结合，形成三元复合物ESI。,（一）可逆性抑制剂与酶非共价结合,1竞争性抑制剂与底物竞争酶的活性中心,定义：抑制剂与底物的结构相似或部分相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,竞争性抑制作用V对S的双倒数作图,*特点,抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；,I与S结构类似，或部分相似，竞争酶的活性中心；,动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。,*举例,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,2非竞争性抑制剂不影响酶对底物的亲和力,*反应模式,非竞争性抑制剂与酶活性中心外的某个部位结合，表现为非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition）。,非竞争性抑制的米氏方程式的双倒数形式,*特点,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；,抑制程度取决于抑制剂的浓度；,动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。,3反竞争性抑制剂只与酶-底物复合物结合,*反应模式,反竞争性抑制作用的米氏方程式的双倒数形式,*特点：,抑制剂只与酶-底物复合物结合；,抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物的浓度；,动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。,各种可逆性抑制作用的比较,（二）不可逆性抑制剂与酶共价结合,不可逆性抑制作用的抑制剂,基团特异性抑制剂（group-specific inhibitor）底物类似物（substrate analog）自杀性抑制剂（suicide inhibitor）,1基团特异性抑制剂与酶分子中特异的基团共价结合,半胱氨酸残基上的巯基是许多酶的必需基团。低浓度的重金属离子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可与巯基酶分子中的巯基结合，使酶失活。,2底物类似物可共价地修饰酶的活性中心,与基团特异性抑制剂不同，底物类似物与底物的结构相似，可特异地与酶的活性中心共价结合，不可逆地抑制酶的活性。此类抑制剂可作为亲和标记物，用来定性酶活性中心的功能基团。,TPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记,酶的自杀性抑制剂可以作为酶的底物与酶活性中心相结合，生成酶-底物复合物，并接受酶的催化作用。然而，经催化后的中间产物不游离出产物，而是转化为酶的抑制剂，进一步与酶活性中心共价结合，对酶产生抑制作用。,3自杀性抑制剂是经过修饰的酶的底物,+,酶-底物复合物 无活性酶中 被修饰的FAD,N，N-二甲基丙炔酰胺,自杀性抑制剂N,N-二甲基丙炔酰胺在被单胺氧化酶氧化后，由于填加1个质子，使之与酶的辅基FAD结合生成稳定的烷化物，从而酶被抑制。,单胺氧化酶通过其辅基FAD氧化N,N-二甲基丙炔酰胺(N,N-dimethylpropargyl amine)：,第四节 酶活性的调节Regulation of Enzyme Activities,机体通过改变调节酶的活性或诱导、阻遏酶的生物合成，可实现细胞代谢水平的调节；物质代谢的整体调节和激素水平的调节最终也都是通过影响酶促反应速率实现的。,一、调节酶的活性可受别构效应剂的调节,（一）别构效应剂与别构酶结合引发酶的构象改变,别构调节(allosteric regulation),一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称别构调节。,别构酶（allosteric enzyme）：能发生别构效应的酶,别构效应剂（allosteric effector）：能引起酶发生构象改变的化合物,调节部位（regulatory site）：别构效应剂与酶结合的部位,别构酶也有两种构象形式，紧缩态(tense state,T state)和松弛态(relaxed state,R state)。T态和R态对底物的亲和力或催化活性不同，别构效应剂就是通过引起酶R态与T态的互变，改变酶的催化速率。,（二）别构效应剂可引起别构酶分子中各亚基间的协同作用,亚基的构象改变可以相互影响，发生协同效应。（cooperativity）,同种协同效应（homotropic cooperativity）,别构效应剂引起的构象改变增加或降低后续亚基对同种别构效应剂的亲和力。,别构效应剂引起的构象改变增加酶对底物的亲和力，这种现象（属于异种正协同效应）称为别构激活作用（allosteric activation）。此别构效应剂称为别构激活剂（allosteric activator）,（三）别构酶的动力学不遵守米-曼氏方程,正协同效应的底物浓度-反应速率曲线为S形曲线,负协同效应的底物-速率曲线外形类似矩形双曲线，但不是矩形双曲线,二、一些调节酶可在催化方向相反的两种酶的作用下发生共价修饰,（一）磷酸化与去磷酸化是最常见的共价修饰方式,共价修饰(covalent modification)或化学修饰(chemical modification),酶分子中的某些基团可在其他酶的催化下，共价结合某些化学基团；同时又可在另一种酶的催化下，将此结合上的化学基团去掉，从而影响酶的活性。,酶的共价修饰种类：,1.磷酸化（phosphorylation）和去磷酸化（dephosphorylation）,2.甲基化（methylation）和去甲基化（demethylation）,3.腺苷化（adenylation）和去腺苷化（deadenylation）,4.尿苷化(uridylation)和去尿苷化（deuridylation）,磷酸化和去磷酸化修饰是最常见的共价修饰,酶的磷酸化与脱磷酸化,（二）共价修饰可引起级联放大效应,在一个连锁反应中，一个酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后续的其他酶可同样的依次被其上游的酶共价修饰而激活，引起原始信号的放大，这种多重共价修饰的连锁反应称为级联反应（cascade reaction）。,级联反应的主要作用是产生快速、高效的放大效应。,三、酶原需经激活后才具有催化活性,酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。,酶原激活的原理,胰蛋白酶原的激活过程,消化蛋白酶原的激活,酶原激活的生理意义,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,第五节酶与医学 Enzymes and Medical Sciences,一、酶与疾病的发生、诊断及治疗密切相关,（一）许多疾病与酶的质和量的异常相关,（二）体液中酶的活性可作为疾病的诊断指标,2.恶性肿瘤可因肿瘤组织的增殖加快，其标志酶释放入血增多，有助于对该组织肿瘤的诊断。,前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量增高。,组织器官损伤可使其组织特异性的酶释放入血，有助于对此组织器官疾病的诊断。,急性肝炎时，血清中丙氨酸转氨酶活性升高。,3.有些酶的清除和排泄障碍也可造成血清含量升高。,肝硬化时血清碱性磷酸酶活性升高。,4.酶的诱导合成增多也可以从血清中检测出来，用于协助诊断和预后判断。,胆管阻塞时胆汁返流可刺激肝合成碱性磷酸酶增多。,（三）酶作为药物可用于疾病的治疗,胰蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等可加强伤口的净化、抗炎和防止浆膜粘连等。在某些外敷药中加入透明质酸酶可以增强药物的扩散作用。,2.有些酶用于清洁伤口和抗炎,（四）有些药物通过抑制或激活体内某种酶的活性起治疗作用,一些药物通过抑制某些酶的活性，纠正体内代谢紊乱。如抗抑郁药通过抑制单胺氧化酶而减少儿茶酚胺的灭活，治疗抑郁症。洛伐他汀通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶的活性，抑制胆固醇的生物合成，降低血胆固醇。给新生儿服用苯巴比妥可诱导肝细胞UDP-葡萄糖醛酸基转移酶的生物合成，减轻新生儿黄疸，防止出现胆红素脑病。,二、酶作为试剂可用于生物化学分析,（一）有些酶可作为酶偶联测定法中的指示酶或辅助酶,当有些酶促反应的底物或产物不能被直接测定时，可偶联另一种或两种酶，使初始反应产物定量地转变为可测量的某种产物，从而测定初始反应的底物、产物或初始酶活性。这种方法称为酶偶联测定法。,若偶联一种酶，这个酶即为指示酶（indicator enzyme）；若偶联两种酶，则前一种酶为辅助酶（auxiliary enzyme），后一种酶为指示酶。,葡糖氧化酶法测定血糖时，过氧化物酶为指示酶。,（二）有些酶可作为酶标记测定法中的标记酶,酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）法就是利用抗原-抗体特异性结合的特点，将标记酶与抗体偶联，对抗原或抗体做出检测的一种方法。,常用的标记酶：辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,葡萄糖氧化酶,-半乳糖苷酶,（三）多种酶成为基因工程常用的工具酶,多种酶已常规用于基因工程操作过程中。例如，型限制性内切核酸酶、DNA连接酶、逆转录酶、DNA聚合酶等。,三、酶工程是对酶进行改造的新型应用技术,酶工程（enzyme engineering）是利用化学的和基因工程方法对酶的结构、理化性质进行改造，或研发新的酶分子，使之具有更高的催化效率、高度稳定性，更容易提取与纯化，便于工业、农业和医药卫生等领域应用的一门技术。,（一）有些酶可通过化学工程手段进行改造,1固定化酶是固相酶,固定化酶（immobilized enzyme）是将水溶性酶用物理或化学方法处理，将其固定于有机或无机物的介质上，或包埋于某种膜中，使之成为不溶于水的、稳定的、可以反复使用的固态酶。,固定化酶可以装柱，这样，固定化酶不但具有酶的高催化效率和高特异性，而且还具有类似离子交换层析和亲和层析的优点，反应自动化、连续化、管道化。,2抗体酶是具有酶活性的抗体,抗体酶（abzyme）是人工制造的具有催化活性的单克隆抗体。,根据酶底物的过渡态与酶的活性中心密切结合并易于生成产物的特性，设计出过渡态分子的类似物，并以此作为抗原，接种于动物体内使之产生相应的抗体。该抗体既然能与过渡态类似物相互适应并结合，也就有可能具有催化过渡态反应的酶活性。这种具有酶活性的抗体，称为抗体酶或催化性抗体（catalytic antibody）。,3对酶活性中心必需基团的化学修饰可改变酶的催化性质,通过对酶活性中心的某一必需基团的化学修饰，改变酶的催化性质。这种酶即保持酶蛋白的理化性质和稳定性，又可使其具有人们预想的催化目的。,4模拟酶是人工合成的具有催化作用的非蛋白质有机化合物,利用有机合成的方法合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物称为模拟酶（mimic enzyme）。,模拟酶具有天然酶的高效、特异催化作用。由于模拟酶是小分子的稳定的化合物，应用方便。同时，模拟酶还克服了天然酶提取纯化的复杂性、耗材多、产量低、酶的不稳定性、生物大分子在应用上的抗原性等许多不便。,（二）基因工程是对酶一级结构的修饰,酶的基因工程是利用重组DNA技术对酶一级结构的修饰，以发现催化活性更高、更稳定的可以大量生产的酶。,