组织化学技术教程.ppt
第三章 组织化学的基本技术 组织化学发展到今天，它的技术多而复杂，但基本技术是容易掌握的。从样品的取材、固定剂的选择、切片的制备、孵育反应、各种溶液的配制以及光镜组织化学技术和电镜组织化学技术等，每项技术都有明确的要求和规范的操作程序。进行没项工作，应事先做好准备，按技术程序进行，可做一定的预备实验，效果稳定后，再开始实验研究，这样才能达到预期的科研效果。,一、样品的取材 样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。如取材的器材；动物标本准备，一般轻微麻醉，迅速取材为好。现将取材的原则和具体要求分述如下：刀剪锐利、洁净。快速、准确、尽量保持生活状态，力争1 分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分 钟。要清楚取材的部位和内部，对病理 组织还应做到以下几点：材部位必须是主要病变区。必须取病灶与正常组织的交界区 必要时取远离病灶的正常组织做对照。,一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。低温操作，防止自溶现象，通常以0-4 的低温条件下操作为佳。定位准确，取材时必须注意样品的定向和 定位，即头、尾、左、右以及上、下方向。切好的样品贴放在滤纸片上，标记好定向标 志，防入预冷固定液内，或冰冻切片或短时 间冷冻保存。样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内，免疫组织化学样品大约在:2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。cm3小块。,二、固定1固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。不仅保持组织生前的形态结构，还要保持 结构的化学成分和活性。促使组织凝固、硬化，保持一定的形状、体积。增加媒染作用，便于染色；增加折光率，便于观察。,杀死活细胞或活组织，以进行组织化学反 应。由于固定的上述目的要求，许多良好 的组织学固定液，却不能用于组织化学标 本，特别是酶组织化学标本和免疫组织化 学标本。2固定剂的选择 用于组织化学的固定剂有很多种，一 般可分为单纯固定剂和混合固定剂两大类。所有的组织化学标本固定必须根据其性质及 所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。,常用组织化学固定剂举例如下：醛类固定剂：甲醛、戊二醛；中性 福尔马林，多聚甲醛等。非醛类：丙酮、酒精、Zenkers液 和Carnoy氏液等等。应用固定剂时应查阅有关的文献资 料，对前人未做的方法应慎用。固 定剂穿透组织的速率有很大特异性，不同的固定液其穿透组织速率可有明 显的不同（穿透因子不同）：t=kde t=时间；d=组织深度；k、e为穿透因子（常数）,3 固定的方法 原位固定法 原位固定法是在保持动物对其器官组织血液供应的条件下，边解剖边向所取样本的部位滴加预冷的固定液的一种方法。这种方法有益于组织细胞酶活性和结构的保存，不足之处是对动物刺激时间较长，因此应快速取样，断头处死动物。浸透固定法 浸透固定法是将组织块浸泡在固定液内而固定的一种方法。在组织化学样品的处理上，对浸透的时间、温度有一定的要求，特别是免疫组织化学样品的要求更严一些。,灌流故定法 灌流故定法是通过血管的途径，将固定液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方法。这种方法的特点是：快速、固定充分，但是对固定液的温度、压力及取材时间有严格的要求。培养细胞和外周血细胞固定法 培养细胞核外周血细胞的固定方法比较特殊，对培养细胞通常取盖片入37的 Hanks液中，漂洗两次(每次35min)，洗除血清后，再置于甲醛缓冲固定液内1030min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛固定或采取双重固定法。,外周血通常采用涂片，以甲醛缓冲固定液固定。电镜酶组化则须离心沉淀后，用戊二醛固定（具体法见第4，5，6章）。4 固定后的处理漂洗 已固定的组织样品，在切片之前必须进行漂洗，其主要目的是洗去组织中存余的固定液。这样做有助于酶活性的提高，可避免样品下一步和其它液相的液体接触，引起组织的结构改变和酶活性的降低，漂洗要求最适的PH值、渗透压、温度和时间来进行,否则会影响试验的结果。,三 组织切片技术 一般的组织化学染色切片厚度要求在57 m左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在20100 m之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有：冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。1冰冻切片 冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。它的突出特点：能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性。,骤冷（Quenching）1）骤冷的目的 最主要的目的是防止标本内的水结成 冰晶破坏标本结构。杀死组织（细胞）。快捷制片。2）骤冷的方法 一般可以用四种方法骤冷，应根据实验室条件选择。,Chayen氏骤冷法（目前常用的骤冷法之一）液氮法(也是常用的骤冷方法之一)冻干燥法（抽干组织中的水分）冷冻替代法（置换组织中的水分）,切片 骤冷后的组织块切片机上切片，目前的 切片机有两类：1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、甲醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片 机）。开放式冰冻切片机由于暴露于空气 中，温度不易控制，技术难度大，现多已 淘汰。2）恒温冰冻切片机（Cryastat）常用 恒温冰冻切片机切片后如不染色，必须冷 风吹干，贮存于低温冰箱内或短暂预固定 后，冰箱贮存。,2 石蜡切片常规石蜡切片、HE染色程序：取材 固定 脱水：升梯度酒精脱水 50%70%80%90%95%100%34h 1.5h 透明：用二甲苯、观察组织块至透明 为止（0.51h，共两次）浸蜡：一般用两个蜡缸。石蜡（601h；石蜡（60）2 h。,包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。染色 HE染色 步骤：1）二甲苯510分钟，脱去切片中的石蜡。2）降浓度梯度酒精脱水（100%95%90%80%70%）。每级脱水23分钟以除二甲苯。3）蒸馏水洗，去乙醇1030分钟。4）苏木精，染细胞核，23分钟。,5）0.5%盐酸酒精分化数秒。6）流水冲洗，3040分钟。7）入伊红23分钟，细胞染成粉红色。8）水洗，去浮色，数秒。9）升梯度酒精脱水（70%80%90%95%100%），每级35分钟。10）二甲苯10分钟，使标本透明。11）封固。酶组化和免疫组化与常规石蜡切片略有不同：脱水透明应在4下进行，以尽量减少酶和抗原的损失。组织块：2cm1.5cm0.3cm。以充分脱水、透明、浸蜡 浸蜡、包埋：60，软蜡为佳。,四、孵育反应 1 配制孵育液的要求 清洗器具，过酸冲洗。现用现配，保持新鲜。严格配比，保持平衡。防止污染，过滤为佳。优选试剂，注意纯度。,2 孵育的温度和时间 温度对酶细胞化学反应影响很大，一般孵育的温度有37（温箱）；1520（室温；04可延长时间，一般为几个小时乃至过夜。最佳条件要根据所用样品的种类以及固定的不同条件而定，因此应借鉴前人的经验安排预实验。,3孵育的方法 常用的孵育方法有两种，即贴片孵育法和漂浮孵育法。贴片孵育法 贴片孵育法是将切片贴在盖片或载物片上进行孵育。若是冰冻切片，须在空气或冷冻干燥后，经缓冲液漂洗，然后入孵育液内。漂浮孵育法 将切片漂浮于孵育液中进行培育，此法技术难度较大,
