制备了伤寒Vi多糖疫苗.ppt

细菌性疫苗,杨丽华 2011年3月,1.死疫苗,2.活疫苗,3.蛋白类疫苗,4.多糖类疫苗,5.多糖蛋白结合疫苗,细菌性疫苗,国药长春所,细菌性疫苗种类,国药长春所,国药长春所,白喉疫苗,一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定,国药长春所,外毒素对神经系统损害,细菌产生的外毒素对心肌损害,外毒素对肾脏损害,白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病,主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，,白喉疫苗,国药长春所,白喉流行特点,1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。,国药长春所,二、病原学,1.细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,国药长春所,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,2.培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为3435。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸 盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。.对消毒剂抵抗力弱，3苯酚10min可将该菌杀死.不耐热，58 10mi或100 1min即可被杀死。,国药长春所,二、病原学,三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学,1.致病力 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前 用于白喉类毒素生产)。,国药长春所,四、白喉毒素,1.白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体tox基因表达 产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55 很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。,国药长春所,毒素经甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性,五、白喉类毒素,国药长春所,甲醛浓度,PH,脱毒,影响脱毒因素,国药长春所,温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果,.温度越高脱毒越快，超过40影响抗原性，一般3738。.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。.甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。,国药长春所,温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高,提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）,类毒素的毒性逆转,国药长春所,六、白喉疫苗工艺流程 菌种（PW8株）传代扩增 34代 发酵罐培养 3435培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体 收集清液 超滤浓缩 硫酸铵两段盐析 除盐除菌 氨离子及无菌检查 脱毒 甲醛液 37 脱毒试验（家兔）原液 检定（浓度、纯度、安全等）Al(OH)3吸附 成品 检定（安全、效价等）,国药长春所,七、类毒素的质量检定,1 絮状单位（Lf）是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。絮状单位测定 毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。2 纯度：1500Lf/mgPN3 安全性试验（豚鼠）,国药长春所,七、类毒素的质量检定,4效价测定 类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。小鼠Vero细胞法 将标准和待检类毒素2倍稀释35个稀释度，皮下免疫N IH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击，观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。,国药长春所,百日咳疫苗,一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗、生产工艺流程、质量检定、APV的效果、接种不良反应,国药长春所,急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤,并发症肺炎形成肺气肿肺不张，甚至死亡。,营养缺乏症,百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。,典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。,百日咳概述,国药长春所,百日咳流行特点,1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1 岁以内婴幼儿发病率50%。,国药长春所,二、病原学,细菌形态 百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形,国药长春所,生长特性,1.百日咳菌可分四种相变，相菌毒力最强有免 疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性；相菌介于 相之间。2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为3536,最 适。3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。,国药长春所,1百日咳相菌有两大类抗原 菌体O抗原 表面K抗原（荚膜物质）2百日咳菌可产生 外毒素(PT)内毒素 其他生物活性物质，据报道有25种之多。,、主要抗原和生物学活性,百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患(FHA PT PRN Agg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能 AC 分泌大量PT麻痹上皮细胞功能 TCT 产生血细胞增多损伤支气管血管周 HLT 细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强 围组织 分泌胰岛素增强和 血糖降低.,、致病机理,国药长春所,三、百日咳疫苗发展简史,粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。全菌体百日咳疫苗(WPV)以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝 集原（Agg1、Agg2、Agg3）。经过50多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题 一直未解决。无细胞百日咳疫苗(APV)20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了APV。基因工程疫苗正在研究中。,国药长春所,四、无细胞百日咳疫苗,1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代 中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PT FHA PRN Agg2 A gg3）的APV效果最佳。,国药长春所,冻干百日咳菌种（相CS菌株）接种血培养基大管培养 36 48-72小时培养 传代 接种发酵罐培养（综合培养基）培养48小时 收集培养物 第一段硫酸铵盐析及浸提 第二段硫酸铵盐析及浸提 透析 密度梯度离心 戊二醛脱毒 透析 超声 无细胞百日咳原液,、生产工艺流程,国药长春所,、质量检定,国药长春所,日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量 控制。美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效价测定采用EL ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验（MPT）评价疫苗效果，WPV 的 效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试 验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方 法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。,国药长春所,效价测定方法探讨,表明APV的保护效果是肯定的，能够达到WPA的保护水平。,、APV的效果,国药长春所,表明APV的不良反应明显低于WPV。,、接种不良反应,国药长春所,伤寒疫苗,一、概述二、病原学三、伤寒疫发展简史四、伤寒Vi疫苗,国药长春所,1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。,一、概述,国药长春所,典型的临床症状,国药长春所,二、病 原 学,1.细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能运动。,国药长春所,伤寒沙门氏菌革兰染色,国药长春所,伤寒沙门氏菌电镜形态,国药长春所,2.培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度35-37，适宜的pH为7.07.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。,1.鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受（1）甲醛影响。2.菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖（LPS）由多糖（重复寡 糖和核心寡糖）和类脂A组 成。3.莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原,Vi抗原与其致病性有关 Vi来源于毒力的缩写。,抗原结构,国药长春所,血清学诊断,1.肥达氏试验（widal test）选择抗原的方法：.测定O抗体 用伤寒0901株（没有H和Vi抗原）用加热杀菌破坏H抗原（不耐热）.测定H抗体 用伤寒S株（没有O菌体抗原）用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原 2.酶联免疫试验,国药长春所,1,2,3,4,全菌体灭活疫苗,口服Ty21a减毒活疫苗,伤寒Vi多糖疫苗,伤寒结合疫苗,二、伤寒疫苗的发展简史,国药长春所,1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗,3.丙酮杀菌疫苗,、全菌体灭活疫苗,国药长春所,甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用甲醛杀菌，0.5石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1亿-亿；副伤寒甲乙由每毫升各亿-.5亿，细菌总量原三联疫苗为20亿-10亿。,国药长春所,加热杀菌石碳酸防腐疫苗,此法历史最久，1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用56水浴30in杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。,国药长春所,丙酮杀菌疫苗,1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。1943年首次在意大利使用，经世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。,国药长春所,伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应,实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。,国药长春所,、口服Ty21a疫苗,70年代末期研究成功的口服伤寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。,国药长春所,口服Ty21a疫苗的特点,1.减毒活疫苗此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-异构酶半乳糖 激酶和半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约8 0。且没有Vi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有 完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能诱导较好 的免疫保护性反应。2.经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家 批准应用。,国药长春所,口服Ty21a疫苗的特点,3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢，产量很低，不易批量生产。4.目前无可靠的检定指标。5.基因背景不够清楚，因为它是用强诱变 剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大 的弱点。,国药长春所,口服Ty21a减毒活疫苗的免疫效果,国药长春所,、伤寒Vi多糖疫苗,1.伤寒Vi多糖疫苗的概述2.伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果3.伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果4.伤寒Vi多糖疫苗的制造工艺5.伤寒Vi多糖疫苗的特点,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗概述,由于Vi抗原是一种表面抗原，是由C3位乙酰化的 N-乙酰-D-半乳糖醛酸（14）连接的同聚体。在美国NIH的Robbins等重新认识伤寒Vi抗原的免 疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类 似的方法提取Vi抗原，以不伤害其抗原结构，保 持它的免疫原性，制备了伤寒Vi多糖疫苗。,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗概述,早期提取Vi 抗原时为了降低LPS的含量，采取1mol/L乙酸100处理24h，使O-乙酰 基和N-乙酰基脱落造成Vi抗原结构变化，导致其免疫原性发生变化。新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤 寒沙门氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙酰 基和N-乙酰基，使其不变性。,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果,国药长春所,（Ty2株）细菌培养 生物反应液体培养（810h）对数生长期末收获,甲醛液灭活 离心去菌体，收上清液 浓缩多糖 上清加10%十六烷基三甲基溴化铵 离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离 除去核酸 加95%乙醇至25%浓度收集上清 上清中加95%乙醇至80%浓度 沉淀粗制多糖，抽干 除去蛋白 加1：10饱和中性醋酸钠溶液溶解多糖 按1：2加冷酚提取3次，离心收集上清 液并透析 沉淀多糖 透析液加95%乙醇至80%沉淀多糖 用无水乙醇和丙酮各洗3次 原液 注射用水溶解多糖并除菌 注射用水稀释分装 成品,伤寒Vi荚膜多糖疫苗工艺流程,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗检定项目及检定指标,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗的特点,安全有效 副反应较菌体疫苗轻，但却 有其大致相同的免疫效果。稳定性好 即可以为液体制剂，也可以 为冻干制品，耐热，易于运输与保存。使用方便 注射一针，即可以有一定的 保护力，易于用理化方法标准化。同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果 差。,国药长春所,结合疫苗,一、结合疫苗的特点二、免疫机理三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、用于制备结合疫苗的蛋白载体五、结合化学制备结合疫苗的主要要素六、结合疫苗应具备的两个共同特征七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向九、存在问题,国药长春所,一、结合疫苗的特点,1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成 了具有一定空间构象的结合物。抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷 等小分子物质。2.它能使多糖抗原的T细胞非依赖性转化为T细胞依 赖性,产生具有记忆特征的IgG抗体,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。3.能够在婴儿产生免疫应答。,国药长春所,二、免疫机理,1.胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）2.胸腺依赖性抗原（TD-Ag）,国药长春所,胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）,细菌脂多糖、荚膜多糖等。TI-Ag分子结构呈长链，O-乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和 磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将 可视为多价的，能与B细胞表面受体结合形成“帽状现象”。可单独触发B细胞产生抗体，不需T辅助性细胞辅助。与TI-Ag发生应答的是B细胞的抗原识别受体IgM（B细胞成 熟的标志），产生的抗体仅为IgM,且抗体效价低、无Ig类 型转换。不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相 同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成 熟过程。,国药长春所,TI Ag,B,IgM,无记忆B细胞（Bm）形成，不产生加强应答，因而免疫原性弱。,B细胞对（TI-Ag）应答特点,国药长春所,胸腺依赖性抗原（TD-Ag）,绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TD-Ag。TD-Ag分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀(就每 种表位而言它是单价的)。此类抗原含有T细胞和B细胞决定簇，蛋白质通过单价表 位的相互作用与B细胞表面IgM受体结合，但不诱导“帽 状现象”，不足以激活B细胞,但被B细胞胞饮、水解后肽 表位与T细胞受体结合诱导TH细胞产生细胞因子。TD-Ag需TH细胞产生细胞因子并激活B2细胞产生抗体,浆 细胞在产生抗体中发生Ig类型转换，合成IgG和IgM类抗 体。形成记忆Bm细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次 应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。,国药长春所,TD-Ag,IgGIgM,记忆B细胞（Bm）形成，产生加强应答，增强免疫原性。,B细胞对（TD-Ag）应答特点,国药长春所,多糖蛋白质结合物（TD-Ag）,将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质 抗原激活TH细胞，能诱导TH细胞产生细胞因子（如r-IFN,IL-2、4、5）并传递给B2细胞，使 之参与免疫应答。TD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用,国药长春所,多糖蛋白质结合物（TD-Ag）,多糖蛋白质结合疫苗免疫优势:1.有TH细胞参与，刺激机体产生的抗体 主要有IgG和少量IgM，能产生细胞免 疫和加强免疫应答，免疫原性强。2.免疫接种范围广，对所有年龄组人群 均能提供免疫保护。,国药长春所,抗体生成的辅助细胞专一地识别载体决定簇,TH细胞,B2细胞,是产生抗体的效应细胞 专一地识别多糖（半抗原）表面抗原识别受体为IgG和IgM产生IgG和IgM。分化增殖过程中有少量B细胞 停止分化变成记忆Bm细胞出现加强应答免疫原性大大提高,TD-Ag,TD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用,国药长春所,一类是细菌的荚膜多糖（CPS）,A/C群脑膜炎球菌,肺炎链球菌,b型流感嗜血杆菌（Hib）和伤寒杆菌,三、用于制备结合疫苗的多糖抗原,国药长春所,另一类为菌体多糖（OPS）,脂多糖（LPS）中的O特异性多糖（O-PS）,脂寡糖（LOS）中的寡糖（OS）,纯化的O-PS和OS没有免疫原性，与蛋白载体制备结合疫苗后可获得免疫原性。抗O-PS的IgG具有型特异性保护，抗OS抗体具有杀菌活性及免疫保护作用。,三、用于制备结合疫苗的多糖抗原,国药长春所,四、用于制备结合疫苗的蛋白载体,1.细菌的分泌性毒素（去除毒性）破伤风类毒素（TT）白喉类毒素（DT）及无毒 CRM197 百日咳毒素（PT）及无毒CRM3201 霍乱肠毒素（CT）及其B亚单（CTB）无毒的重组绿脓杆菌外毒素（rEPA）大肠杆菌热敏感肠毒素（HLT）2.细菌菌毛 绿脓杆菌菌毛（PAP）淋球菌P-3-2菌毛,国药长春所,四、用于制备结合疫苗的蛋白载体,3.细菌外膜蛋白 B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）4.病原蛋白质 如乙肝表面抗原（HsAg）5.B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）6.伤寒杆菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLY）也是 很有潜力的结合蛋白。7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸,国药长春所,1.多糖抗原的选择 细菌的保护性抗原 荚膜多糖（CPS）菌体多糖（OPS）2.多糖分子大小选择 天然多糖 经降解后的寡多糖。,五、结合化学制备结合疫苗的要素,国药长春所,3.载体蛋白的选择 破伤风类毒素（TT）白喉类毒素（DT）4.多糖和蛋白质活性功能基团 天然的 修饰的5.结合模式,五、结合化学制备结合疫苗的要素,国药长春所,4.偶联反应可利用的化学功能团,国药长春所,按照结合方法可分为两种结合模式两种抗原的直接结合 一般限于羧基和具有一级氨基醛基之间的缩合反应，其产物需要进一步还原才能稳定。两种抗原通过化学双功能连接剂的结合 在多糖和载体蛋白之间使用一个连接物，不但可增加结合物的收率，而且可大大增强其免疫原性。现有的连接剂按其性质可分为两种。,5.结合模式,国药长春所,5.结合模式,异种双功能连接剂：SPDP（-琥珀酰 胺-3-二硫 代呲啶丙酸）同种双功能连接剂 AH（已二酰肼）EDAC(碳二亚胺)戊二醛。不同的连接剂所带的活性功能团不同,因而要求抗原中相应不同的活性功能团与之反应。,国药长春所,5.结合模式,按照多糖蛋白质偶联物的分子构象分为两种连接模式 末端连接模式 交叉连接模,国药长春所,5.结合模式,末端连接模式 一个载体蛋白上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，糖链与蛋白质载体可以直接连接，也可以通过小分子桥连接。,5.结合模式,交叉连接模 该模式的每一个载体蛋白或每一个糖链上都可以 有多个相互连接位点，结合物形成网状交连体。随着糖链长度的延长，连接点的增加，交连体的 分子质量会相应增大，其三维空间结构更为复杂.,国药长春所,结合疫苗制备常用的四种化学结合方案,国药长春所,1.氨基还原法（直接结合）,糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式 存在，在氨基存在的情况下与之形成shi ff氏碱。用还原剂将氨基还原成二级亚胺,从而 形成稳定的多糖蛋白结合物。,国药长春所,3.CNBr-ADH 酰胺化反应法,在碱性条件下用CNBr活化多糖分子上的羟基（-OH）形成氰酸脂。然后与ADH反应将脂酰肼（AH）基团导入多 糖分子形成PS-AH衍生物。最后在EDAC的介导下与蛋白载体形成稳定的 结合物。,国药长春所,4.SPDP（二硫化物交换）法,首先在EDAC的介导下将多糖分子中的羧基与 胱氨酸上的氨基通过肽键结合，形成含有二 硫键（-S-S-）的衍生物，然后用二硫基苏 糖醇将双硫键还原成自由的巯基（-SH）,即 多糖-SH衍生物。另将SPDP与蛋白质载体反应形成蛋白质衍生物最终两种衍生物在水溶液中微碱条件下由于二 硫基和巯基之间的交换，形成稳定的含有二硫 键的多糖蛋白质复合物。,国药长春所,六、结合疫苗的两个共同特征,结构特征1.多糖抗原与载体蛋白质之间以化学共 价键牢固地接合。2.多糖分子大小与载体蛋白的结合比有 利于刺激机体产生最强的针对多糖 免疫应答。3.重复制备性及稳定性好，有效期较长。4.作为多价或单价疫苗易于标准化。,国药长春所,六、结合疫苗的两个共同特征,功能特征1.多糖蛋白质结合疫苗无毒、安全。2.注射机体后能同时诱发细胞免疫和细 胞依赖性免疫，血清中存在高滴度的杀 菌抗体。3.能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫应答。4.对某些细菌衍生物载体蛋白不产生加强 免疫反应。,国药长春所,结合疫苗检定项目及指标,国药长春所,七、结合疫苗的使用和发展现状,国药长春所,八、结合疫苗的研究方向,1.已逐渐扩展到真菌、寄生虫、人体分泌的激素更为广泛的 结合疫苗范围。2.由于其接种效果在儿童中尤为显著，更是儿童疫苗研制的 一个热点。3.免疫细胞被激活不仅需要有效抗原刺激，同时需要多种刺 激信号，而这种信号部分来源于细胞因子，怎样将结合疫 苗与细胞因子联合应用，以达到有效免疫的效果是今后的 研究方向之一。4.发展和使用更具免疫活力的蛋白质载体将是新的焦点，在H ib结合疫苗基础研究中，不同载体蛋白，三次免疫后血清 抗体水平高于同一载体蛋白的结合疫苗（不同载体蛋白结 合同一多糖时激活的TH细胞的克隆系多于单一载体蛋白）。,国药长春所,九、存在问题,1.作为一个单一多糖疫苗基础上进一步化学结合 的疫苗，其制造成本较高，发展受到一定限制。2.在具体化学合成中还存在许多问题，其中如多糖 和载体蛋白质在结合中均存在自身交联而变形，产生一种新抗原（副反应物）的可能，如何控制 它的发生还是一个比较棘手的问题。,国药长春所,谢谢!,国药长春所,