生物大分子相互作用.ppt

生物大分子相互作用,EGFR-ERK/MAPK信号通路核心蛋白互作网络,生命系统复杂性最重要的特征不仅在于其组成成分的复杂性，更在于各组成成分之间的关系，而在所有的这些关系中，蛋白质之间的相互作用在形成几乎所有生命系统、调控各种生理/病理进程中发挥至关重要的作用。,BAKER M.(2012).Proteomics:The interaction map.Nature,484,271-5.,互 作 组,蛋白与蛋白相互作用,蛋白质网络可以被表示成为一个无向图，其中每个节点表示一个蛋白质，每条边表示一对蛋白质节点之间的相互作用。,有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。,通过神经递质乙酰胆碱调节心肌收缩,我们体内有些肽是细胞间的化学信号，控制着情绪、行为、压力应答、血压、消化和癌症发展。它们一般与细胞膜上的受体蛋白相互作用，例如G蛋白偶联受体GPCR。GPCR负责将信息传达到细胞内的G蛋白，从而诱导产生特定的细胞反应。用药物激活这类GPCR可以改善相关疾病的治疗，不幸的是这类药物的研发特别困难，其中有部分原因就是缺少结合状态或激活状态的结构信息。,HAUSCH F,HOLSBOER F.(2012).Structural biology:Snapshot of an activated peptide receptor.Nature.,蛋白质间的相互作用力,蛋白质内部：肽键蛋白质间：非共价键 氢键 范德华力 疏水键 离子键,DNA与蛋白质相互作用,组蛋白与非组蛋白,真核的染色体是由DNA与组蛋白（histone proteins）、非组蛋白(nonhistone proteins，NHP)构成的复合物。基因转录的调节最终必定涉及特殊DNA的核苷酸序列，这些序列可被相应的调节物分子所识别,非组蛋白的调节功能,非组蛋白特异调节作用的的证据来自染色质重建实验。一个细胞的染色体可以解离成DNA，组蛋白和非组蛋白三种组份。来自不同类型染色质组份能够重新建成染色质。若将无转录活性细胞中的DNA、组蛋白与具有转录活性细胞中的非组蛋白相混合，将会产生转录活性,转录水平的调控 顺式作用元件和反式作用因子：(1)核心启动子成分，如 TATA 框；(2)上游启动子分，如 CAAT框,GC框;(3)远上游顺序：如增强子，减弱子、静 息 子,酵 母 的 UAS（upstreamactivator sequences）等。(4)特殊细胞中的启动子成分：如淋巴 细胞中的 Oct(octamer）和B。,增强子(transcriptional enhancer)：是真核生物基因转录中另一种顺式调控元件，常位于启动子上游7001000bp处，离转录起始点较远，可提高转录效率。,反式作用因子可以分为3类；(1)通用反式作用因子，主要识别启动子的核 心启动成分，如TBP；（2）特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细 胞中的Oct-2；（3）和反应性元件（response elenents）相结合的反 式作用因子。如HSE（热休克反应元件，heat shock response element），GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）；MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element);,(一)蛋白质直接和DNA结合1.螺旋转角螺旋（Helix-turn-helix,HTH）：如LacO的R蛋白，的CI，Cro蛋白，涉及酵母交配型的a1和a2蛋白。真核生物中的Oct-1和Oct-2；2.锌指结构（zinc fimger）单个的锌指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His 型:2Cys/2His:TF IIIA,SP1 型:2cys/2cys:GAL4,3.亮氨酸拉链（Leucine ziipper）同二聚体（honwdimers）异二聚体（hefercdimers）C-Jun,C-Fos,Myc,4.螺旋一环一螺旋（HLH）在HLH中带有碱性区的肽链称为 碱性HLH（bHLH，protein）。bHLH又分为两类。A类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇da（daughterless,性别控制的总开关基因）的产物；B类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的MyoD(肌浆蛋白（myogen）基因的转录因子 果蝇的AC-S（achaete-scute 无刚毛基因的产物）,5同源异形结构域（Homeodomains，HD）是一种编码60aa的序列，长180bp，它存在于很多控制果蝇早期发育基因中，在高等生物中也发现了相关基序。HD的C-端区域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有几点不同:（1）HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟，长17aa；而阻遏蛋白由5个-螺旋构成，螺旋3长仅9个 aa；（2）原核的HTH的以二聚体形式与DNA结合，靶序列是回文结构，而HD是以单体形式与DNA结合，靶序列不是回文结构；（3）HD N-端的臂位于小沟，而HTH螺旋1的末端与DNA的背面接触。,（二）蛋白质和配基的结合 甾类受体蛋白一般都具有3个不同的功能区：（1）N-端区是激活转录所需的区域，不 同受体之间此区的同一性仅小于15%；（2）DNA结合及转录活化区，同一性较高为94-42%；（3）C-端的激素结合和二聚体形成区，同一性为57-15%。,噬菌体展示酵母双杂交技术免疫共沉淀染色质免疫沉淀技术表面等离子共振荧光共振能量转移串联亲和纯化,生物大分子相互作用研究方法,蛋白相互作用,酵母双杂交系统噬菌体展示免疫共沉淀,酵母双杂交系统,基本原理,典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。,动画,将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用,1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。,用途,优点,蛋白-蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。大规模筛选操作简单，直观（可以用荧光做报告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等）,缺点,1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。,噬菌体展示技术,一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体.,广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域,噬菌体展示的基本原理(1)在p 和p 衣壳蛋白的N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别；(2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；(3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来.,噬菌体展示技术的应用,噬菌体随机多肽文库噬菌体抗体库蛋白质的定向改造cDNA 文库的表达筛选,应用噬菌体展示，可合成、筛选到许多我们想要的蛋白（如融合肽、抗体、酶），这些蛋白具有预期的催化特性或结合亲和力，或者具有用于胞内、胞外诊断、人体疾病免疫治疗和生物催化作用时所需的特异性。,噬菌体展示技术的优点,高通量的淘选可用于模拟表位的筛选易于纯化,高通量的淘选,将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。,可用于模拟表位的筛选,利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多李全喜等（1997）利用单抗9E10筛选噬菌体随机肽库，结果获得了两个阳性克隆，其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。,易于纯化,重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。目前用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13单链噬菌体。由于M13噬菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。,用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）,缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用,通过质谱确定捕获的蛋白,应用,通常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合产生相互作用。用于验证确定某种特定蛋白质的新的作用搭档。,注意的问题,1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质 相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG,优点,Co-IP是检测蛋白质间相互作用的经典方法，在此方法中,蛋白质及复合物均以天然状态存在，符合体内实际情况，能更真实的反映出蛋白质间的相互作用情况，得到的蛋白可信度高,局限性,1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用。2）不能给出动态的结果，同时也还应该排除细胞在破碎时导致本来没有相互作用的蛋白质发生凝聚的可能性3）所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的蛋白质,而是通过第三者间接相互作用的蛋白质,利用免疫共沉淀（CO-IP）技术、酶联免疫（ELISA）都可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。,凝胶阻滞分析（Gel shift Assay）染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）,DNA与蛋白相互作用,凝胶阻滞分析（Gel shift Assay，Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA）该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。,ChIP,染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。,该技术主要应用于：,1.组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系2.转录调控分析3.药物开发研究,基本的实验步骤以及需要注意的问题,1.细胞固定甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止,2.染色质断裂,交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。,3.染色质免疫沉淀,Input对照Beads选择抗体选择阳性与阴性对照,4.交联反应的逆转和DNA的纯化,用不含DNase的RNase和Proteinase K，65度保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。,5 DNA的鉴定方法半定量PCR和Real-time PCR,CHIP on Chip,将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合,Chip Seq,由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。,表面等离子共振(SPR),实时分析，简便快捷地监测DNA与蛋白质之间、蛋白质分子之间以及药物蛋白质、核酸核酸、抗原抗体、受体配体等等生物分子之间的相互作用，在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测、法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。,表面等离子共振原理,1.消逝波2.等离子波3.SPR的光学原理,1.消逝波,当光从光密介质入射到光疏介质时（n1n2）就会有全反射现象的产生。,n1 sin1=n2 sin2,菲涅尔定理：,密,疏,密,疏,1.消逝波,这表示沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波，这就是消逝波。全反射的光波会透过光疏介质约为光波波长的一个深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。光的总能量没有发生改变。透入光疏介质的光波成为消逝波。,界面,疏,密,2.等离子波,等离子体 等离子体通常是指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。金属表面等离子波 把金属的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。由于电磁振荡形成了等离子波。,SPR光学原理,光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质（假设为金属介质）中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。,SPR光学原理,当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。,SPR光学原理,可以从反射光强的响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。这就是SPR对物质结合检测的基本原理。,SPR的响应模式,Biacore 3000的光学系统,传感芯片分子敏感膜,成膜方法：金属膜直接吸附法共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）单分子复合膜法分子印膜技术,展望未来,如今，SPR技术已被广泛地用来分析生物分子,Main Advantages,实时监测无需标记样品样品需要极少 检测过程方便快捷，灵敏度较高应用范围广泛-,Disadvantages,传感曲线经常不符合假一级动力学,多价结合多步结合反应空间位阻效应配体或者分析物的不均一扩散速度限制重结合现象,荧光共振能量转移技术,荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。,GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能,为FRET技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。,串联亲和纯化(TAP),是近年来发展出来的一种能够快速研究生理条件下的蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术，如今已经成为研究蛋白质组学的一个广泛采纳的工具这种技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下捕捉出特定的蛋白质及其作用伙伴，借助于质谱分析技术，研究人员就可鉴别出这种蛋白质相互作用组。,标签共分3部分：,蛋白A钙调素结合多肽(calmodulin binding peptide。CBP)中间连接的烟草病毒(TEV)蛋白酶识别的酶切位点。,带有TAP标签的融合蛋白在细胞中表达，且与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IsG偶联的层析柱纯化，蛋白A与IgG特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEv酶切割分离蛋白A标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离，并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂后CBP与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列。,Stitch-seq技术,