高美华《医学免疫学》westernblot-zb-第三部分.ppt

Western blot 实验技术,张 蓓,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,一、实验原理 Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。第二阶段：电转移。第三阶段：固相酶免疫测定。,三、固相酶免疫测定检测ENA自身抗体,（一）原理,（二）材料 1、洗涤液：含0.05吐温-20的pH7.4的PBS 2、酶标抗人IgG 3、阴性对照血清、阳性对照血清 4、底物溶液 5、终止液 6、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、滴管、吸管等。,（三）方法 1次日取出已封闭的NC膜，用洗涤液漂洗5次，每次1min。2.将剪下条带放入反应槽中，加入1ml洗涤液，再已加入20l血清混匀，37恒温摇动40min。3取出洗涤液漂洗5次，每次1min。4加入1ml酶标羊抗人IgG，37恒温摇动30min。5取出洗涤液漂洗5次，每次1min。6加入底物液1ml，显色10min。7加入终止液终止反应。,结果判断 用肉眼观察。出现染色条带为阳性，不出现染色条带为阴性，不同的疾病可以出现不同的条带。跟据条带位置 判断结果。判断标准：1抗Sm抗体：同时出现29KD、28KD、13.5KD条带。2抗SSA抗体：60KD、52KD任意出现一条带。3抗SSB抗体：47KD、45KD应用时出现条带。4抗Jo-1抗体：55KD出现条带。5抗Scl-70抗体：同时出现86KD、67KD条带。,