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使用尼龙网做大量未成熟牛卵母细胞玻璃化的实验H. Matsumoto, J. Y. Jiang, T. Tanaka, H. Sasada, E. Sato对于卵母细胞和胚胎细胞的玻璃化技术最近通过新的物理技术的支持，例如电镜网格 法、开放式拉长塑料细管法、冷冻环法等方法有了提高。然而，每个容器中的样品数量往往 受到这些不同方法的限制。在最近的研究中，为了改进一种简洁新型的容器为做大量卵母细 胞和胚胎细胞玻璃化，我们检查了用尼龙网作为大量未成熟的卵母细胞和胚胎细胞玻璃化的 新型容器。结果显示，与原先1个网格只有15个卵冠丘复合体细胞的玻璃化容器相比，用 尼龙法做时多达65卵冠丘复合体能够被放置在尼龙网格上。尼龙法做的玻璃化细胞在复苏 率上高于电镜网格法，而受精率和生长率两者则没有明显的不同。这些结果表明用尼龙法做 玻璃化保存更加有效，而且提供了一种为大量卵母细胞冷冻保存的新的方法。关键词：玻璃化、尼龙网法、电镜网格法、牛卵母细胞。玻璃化保存现在已经被广泛的应用，而且被视作一种可以用作传统慢速程序冷冻（12） 的潜在选择方法。它的主要目的是最大限度的减少冰晶对细胞的损伤。当胚胎细胞被玻璃化 冷冻保存的时候，通过用高浓度的冷冻保护剂和高冷暖率来防止冰晶的产生。然而，大多数 玻璃化方法在冷却、储藏、复温时运用标准的塑料吸管法来固定细胞，但是这些塑料吸管对 于冷暖率的最大范围小于2000/min。替代的方法可以用电镜网格法（7,10,11）、薄壁 开放拉长的塑料吸管法（16）或者冷冻环法（6），允许胚胎细胞的培养基和液氮直接接 触来提高已经发表过的冷暖率。有了这些方法，玻璃化步骤的成功率得以提高。这些容器要 求很小体积的胚胎细胞悬液（小于1-2mL）。然而，在电镜网格法和开放式拉长塑料细管 法中，每个容器中的样品数分别限制在10-15和4-6每格（冷冻环法的限制数还没有报道 过）。因此，这些方法不是非常适合用在大量卵母细胞和胚胎细胞玻璃化的实验上。大量的 牛卵母细胞可以在短时间内从屠宰场的子房中收集。为了适应新的牛卵母细胞玻璃化保存技 术，需要对实验的步骤多次重复。在玻璃化大量果蝇的胚胎细胞时，需要用聚碳酸酯膜（12- 或者10-mm孔径）（8,9）。一个过滤膜对于玻璃化大量牛卵母细胞是非常有用的。然而，一 个大孔径可以减少包含卵母细胞的溶液的体积，如电镜网格（55-mm网孔大小）和尼龙网 法（60-mm网孔大小）。在最近的研究中，我们检查了用尼龙网（60-mm网孔大小）作为 玻璃化大量未成熟牛卵母细胞的新型容器。牛卵母细胞从当地的屠宰场获得并且在一个小时内，在37°C下运送到实验室的。卵母 细胞和积云细胞通过卵泡穿刺法收集到。收集到的20-30个OCCs被放进100mL包含有 TCM 199和5%的牛犊胎儿血清的培养基中，并用矿物油盖好，置于5%CO2和39°C的加 湿环境下。未成熟的OCCs要在3小时内进行玻璃化。一个薄的格子T400H网孔（55-mm网孔大小）（2720；日清时间，东京，日本）被用 作电镜网格法的固定格子。一个格子里可以装大约10到15的OOCs。尼龙网，60-mm网 孔大小（DIN100；瑞士赛发公司，罗什里空，瑞士），被用作固定的格子。尼龙网被切成三 角形，底和高分别是大约1.0和1.3cm。为了操作方便，纱包的涤纶线（0.2mm直径）和尼龙 网（Fig.1）系上。在使用前，EM网格和尼龙网分别用用高压蒸汽灭菌法和同环氧乙烷进行消 毒。在这次研究中，OCCs在每个尼龙网格上的数量大约是10-20或者40-65。FIG. 1,在玻璃化中被用来作为物理支持。电镜网格和尼龙网用来作为低温储藏未成熟牛卵母细胞的容 器。标尺为2mm。准备好的玻璃化溶液EFS40，根据前面所讲的方法（4），在PB1中加入40%（v/v）乙二 醇，18%（v/v）Ficoll-70，和 0.3M蔗糖。尼龙网或者EM网格要放在过滤纸上除去多余的溶液。 卵母细胞在室温下在EFS40中漂洗，然后放在尼龙网和EM网格上。在30-50s内直接嵌 入一个2-mL聚丙烯管（ms-4503; Sumitomo Bakelite公司，东京，日本）安装在一个充满着的 LN2的铝管上。这个管子要迅速浸没在LN2容器中。这个罐子不是密封的，因为网不会浮 在LN2上，而是蔓延并且附在管壁上。在LN2中储存了 1小时后，OCCs迅速加热，在加 热的玻璃化OCCs中冷冻保护剂要在37C下通过四个步骤除去。第一步，尼龙网或者EM 网格要从LN2中脱离，然后转入1mL含有0.5M蔗糖的PB1中。过5秒后，再将尼龙网或者EM网格快速转入进1mL含有0.5M蔗糖的PB1中，然后在37° C下培养55秒。尼龙网 或者EM网格继续快速转入进1mL含有0.25M蔗糖的PB1中培养1分钟，快速转入 进1mL含有0.125M蔗糖的PB1中培养1分钟，快速转入进1mL PB1中培养5分钟。 在这些步骤中，任何从网上掉落的OCCs都用吸液管转入到下一个步骤。经过复温，OOCs在100p L新鲜培养基中培养19-20小时(总共22-23小时)。当在含 有1%透明质酸酶的PBS中，用吸液管重复几次将积云细胞除去以后，一些卵母细胞要在 乙酸/乙醇(1/3,v/v)中混合三天，然后用含1%的地衣红(w/v)的45%乙酸染色。卵母细胞 的核酸构型可以用差相显微镜来检查到。单次射出的公牛精子冷冻在蛋黄中，Tris buffer/glycerol缓冲液在体外受精时要用到。 解冻的精子在含有2.5nM茶碱的BO培养基(1)中需要通过离心机洗涤两次，离心的条 件是600G，8分钟。10到20的OCCs和精子在5%CO2和9°C的加湿环境下，培养基 上有矿物油盖好，在浓度为5*106精子/mL的含有mg/mL BSA和2.5mM茶碱的100-|J l小滴mBO培养基上一起培养。在积云细胞移除的18小时后入卵受精，假定的受精卵用 培养液洗涤三次用作体外生长，一个合成培养基包含22中氨基酸(1mM谷氨酰胺，5mM 甘氨酸，2mM牛磺酸，必需氨基酸作为基础培养基(BME)，非必需氨基酸为最基本培养基 (MEM)，10p L/mL胰岛素，和1mg/mL PVA(14)。几组20到30为一组的假定受精卵在50mL 培养基中培养，并用矿物油盖好，置于5%CO2、5%O2、95%N2 和 39C的加湿环境下。复 苏，成熟，受精和生长时的数据用X2检验检测。ABFIG.2,在电镜网格(A,D)和在尼龙网上(B,C,E,F)经过玻璃化后的复热的OCCs。A,B,C分别显示的是OCCs 在电镜网格和尼龙网上的情况°D,E,F分别显示的是A,B,C上的OCCs经过复温后的情况。标尺为2mm(A-C) 和 300 WD-F).Fig.2显示的是在EM网格和在尼龙网上经过玻璃化后的复热的OCCs。裸露分解的卵 母细胞在洗涤的时候被清除。Fig.3A显示的是在正常的OCCs用作玻璃化卵母细胞的复苏 率。洗涤后，OCCs被转入进IVM滴液中。正常的OCCs玻璃化卵母细胞用尼龙网(10-20) (94%； 397/421)和尼龙网(40-65)(97%； 1006/1033)比用 EM 网格(84%，411/488) (P<0.05)做的玻璃化卵母细胞的复苏率高。用尼龙网做的大数量的玻璃化OCCs(97%)比 小数量的玻璃化OCCs(94%)的复苏率高(P<0.05)。由于EM网格的有效区域很小(大约 3.1mm2,Fig.1)，因此，卵母细胞的数量就受到了限制，大约是15 OCCs(Fig.2A)。而 尼龙网的有效区域(大约65.0mm2,Fig.1)，比EM网格的有效区域大的多。这片大的有效 区域可以简化操作，方便装载和复苏正常的卵母细胞(Fig.2B和2C)，而且可以有效的防止 OCC 损伤(Fig.3A)。Fig.3B显示的是经过IVM处理的核酸构象。一些卵母细胞生长成幼囊泡而分解 (GVBD)的分解率，未玻璃化或者用EM网格、尼龙网(10-20)、尼龙网(40-65)分别是 97%(351/362), 56% (89/158), 70% (89/128),和 73% (214/295)。用尼龙网的 GVBD 率比用 EM 网格的高(P<0.05)。GVBD表示的是玻璃化后细胞的成活率，一样能为未玻璃化的卵母 细胞的GVBD是97%。因此，用尼龙网做玻璃化成活率高。中期II(MII)的卵母细胞未 玻璃化或者用EM网格、尼龙网(10-20)、尼龙网(40-65)的成活率为70% (252/362), 20%(31/158), 19% (24/128)和10% (30/295)。小数量的OCCs在EM网格和尼龙网上玻璃化 的MII率比大数量的OCCs在尼龙网上玻璃化的MII率高。Fig.3C显示的是细胞的受精和生长率。大于等于两个细胞的胚胎期的卵母细胞的受精 和生长率未玻璃化、EM网格(10-15)、尼龙网(10-20)、尼龙网(40-65)上分别为46% (183/401), 7% (5/71),10% (10/98)和 13% (59/470)。大于等于四个细胞的胚胎期的卵母细胞的 受精和生长率未玻璃化、EM网格(10-15)、尼龙网(10-20)、尼龙网(40-65)上分别为 36% (144/401), 3%(2/71), 7% (7/98),和9% (42/470)。大于等于八个细胞的胚胎期的卵母细胞 的受精和生长率未玻璃化、EM网格(10-15)、尼龙网(10-20)、尼龙网(40-65)上分别 为26% (105/401),1%(1/71), 2% (2/98),和3% (16/470)。大于等于桑葚胚时期的未玻璃化的 卵母细胞的生长率是13%(51/401)，然而经过玻璃化的卵母细胞在桑葚胚时期没有生长。 对于在两个到八个细胞的胚胎期的在尼龙网上和在EM网格上的生长率差别不是很明显。 虽然尼龙网做的大数量的玻璃化的OCCs的MII率比用EM网格做的低，但是这两组的受精 和生长率差别不是非常明显。这些结果表明用尼龙网做玻璃化和EM网格一样有效。非常敏感，而GV卵母细胞对寒冷比MII卵母细胞更加敏感（3）。不管其他的研究结果，在 牛（5,13），鼠（2），和人（15）上一句取得了验证。用慢速融解的方法将冻融的GV卵母 细胞在桑葚胚时期在桑葚胚时期以后生长取得了成功（5,13）。但是我们不能提高成熟率、 受精率、和生长率。虽然尼龙网（13%, 59/470）的受精率和EM网格（7%, 5/71）的受精率没有 什么差别，但是我们用尼龙网法获得比用EM网格法更多的两个细胞的胚胎。对于未成熟的（GV）卵母细胞的冷冻方法可以使得繁殖程序得以简化，例如体外受精、克隆和干细胞生 物学。为了这些目的，需要使用大量的冷冻卵母细胞。因此，我们的方法对于简化繁殖程序 是非常有效的。玻璃化方法的改进（如，优化玻璃化的溶液物质、对玻璃化溶液的曝光时间 的调整或者复温方法的改进）也许可以简化细胞生长到桑葚胚时期的时间和用尼龙网对卵母 细胞进行玻璃化的过程。总结，我们用尼龙网作为新型可操作的玻璃化容器，用于大数量卵母细胞的玻璃后保 存。用尼龙网法进行玻璃化的技术不仅简单而且便宜。因为EM网格主要用于牛OCCs（7）、 牛胚胎（10）、和人受精卵（11）玻璃化保存，而尼龙网能够用于其它哺乳卵母细胞和胚胎 的玻璃化保存。参考文献：1. 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