生物化学-蛋白质.ppt

第三章 蛋白质（氨基酸）,第一节 蛋白质通论第二节 蛋白质组成第四章 蛋白质结构第四节 几种重要的蛋白质类型 第五章 蛋白质的性质第六节 蛋白质的结构和功能的关系,蛋白质化学,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,第一节 蛋白质通论 一、蛋白质化学研究史,1838年 Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后,发现它 们均可以用C40H62N10O12 来表示,命名为Protein(意为to take the first place),并发展成 基团 学说 19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸,基团学说消声匿迹1902年 Fischer同Hofmeiste时提出肽键理论1924年 Svedberg 发明超离心机1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：-螺旋和-折叠1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构1958年 Perutz&Kendrew用X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构1961年 Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其立体结构1980年代 蛋白质工程的兴起1997年 蛋白组研究的概念1999年 蛋白质芯片技术出现,二、蛋白质的分类,1、依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。,clasification,2、依据蛋白质的组成分类,按照蛋白质的组成，可以分为:简单蛋白(simple protein)结合蛋白(conjugated protein),（1）、简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。A、清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。B、谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。C、精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。D、硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,（2）、结合蛋白,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，A、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。B、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。C、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。D、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。,E、金属蛋白 由蛋白质和金属组成，如：铁硫蛋白、细胞色素等。F、磷蛋白 由磷酸和蛋白质组成。如：胃蛋白酶、酪蛋白等。,（2）、结合蛋白,三、蛋白质的功能,1、催化功能 酶（淀粉酶）2、调节功能 激素（胰岛素）3、运动功能 肌球蛋白4、运输功能 血红蛋白5、防御功能 免疫球蛋白6、营养功能 酪蛋白7、结构成分 胶原蛋白 8、支架作用 微管蛋白9、异常功能 甜蛋白（应乐果蛋白）,返回,第二节、蛋白质的组成一、元素组成,大量元素C 5055%H 6-8%O 20-23%N 15-18%S 0-4%,微量元素Fe Cu MnZn Co MgI,二、蛋白质的构件单位-氨基酸,除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。20种基本氨基酸按R的极性可分为非极性氨基酸、极性性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。,-氨基酸,可变部分,不变部分,Amino acid,（一）、氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,脂肪族氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline,亚氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,氨基酸的结,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸 Trytophan,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine组氨酸 Histidine,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺 Asparagine谷酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,（二）、几种重要的不常见氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,（三）非蛋白天然氨基酸,高丝氨酸高半胱氨酸瓜氨酸鸟氨酸,（五）氨基酸的物理性质 1、一般物理性质,无色晶体，熔点较高（200一300），水中溶解度各不同，取决于侧链。在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe,利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。,Trp,Tyr和Phe的紫外吸收,2、氨基酸的旋光性,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据,3、氨基酸的构型L型氨基酸 与 D型氨基酸,L-amino acid,D-amino acid,L和D型氨基酸,4、两性解离及等电点,（1）氨基酸的离解性质 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在,在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,PH 1 7 10净电荷+1 0-1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,（2）、氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。等电点的计算 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 硷性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,（六）氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（1）与甲醛发生羟甲基化反应,用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度。,（六）氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（2）与亚硝酸反应,用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应。,（六）氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（3）酰化反应,用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等。,（六）、氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（4）烃基化反应,用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。,（六）、氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（5）生成西佛碱的反应,用途：是多种酶促反应的中间过程。,（六）、氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,（6）脱氨基和转氨基反应,用途：酶催化的反应。,（六）、氨基酸的化学性质,氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于水。,2-羧基参与的反应,（1）成盐反应,用途：识别溶液 食品等里有无重金属的存在,（六）、氨基酸的化学性质,1,1-氨基参与的反应,（2）形成酯的反应,用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。,2-羧基参与的反应,（六）、氨基酸的化学性质,1,（3）形成酰卤的反应,用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。,2-羧基参与的反应,（六）、氨基酸的化学性质,（4）叠氮化反应,用途：常作为多肽合成活性中间体。,2-羧基参与的反应,（六）、氨基酸的化学性质,1,（5）脱羧反应,用途：酶催化的反应。,2-羧基参与的反应,（六）、氨基酸的化学性质,1,(1)与茚三酮反应,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。,3-氨基和羧基共同参与的反应,茚三酮,水合茚三酮,（六）、氨基酸的化学性质,1,（2）成肽反应,用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。,3-氨基和羧基共同参与的反应,4侧链基团的化学性质,巯基（-SH）的性质,1,作用：这些反应可用于巯基的保护。,4侧链基团的化学性质,巯基（-SH）的性质,作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒。,4侧链基团的化学性质,(1)巯基（-SH）的性质,作用：可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量。,硝基苯甲酸二硫化合物(DTNB),4侧链基团的化学性质,(1)巯基（-SH）的性质,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或端裂。,胱氨酸,4侧链基团的化学性质,（2）羟基的性质,1,作用：可用于修饰蛋白质。,二异丙基氟磷酸酯,4侧链基团的化学性质,（3）咪唑基的性质,组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生理条件下具有缓冲作用。组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。可以与ATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失,作用：。,4侧链基团的化学性质,（4）甲硫基的性质,1,作用：。,（七）、氨基酸的分离分析,1、分配柱层析：支持剂是一些具有亲水性的不溶性物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。2、滤纸层析：3、薄层层析：4、离子交换层析：阴离子交换树脂-N(CH3)3OH，阳离子交换树脂-SO3H5、电泳：,（八）、氨基酸的化学合成,目前氨基酸的合成方法有5种：（1）直接发酵法；（2）添加前体发酵法；（3）酶法；（4）化学合成法；（5）蛋白质水解提取法。通常将直接发酵法和添加前体发酵法统称为发酵法。,合成方法,（八）、氨基酸的合成,通过对菌株的诱变处理，产生的新微生物某代谢物在体内积累，从而达到生产的目的。直接发酵法以葡萄糖，氨等为原料。应用直接发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸，其次是赖氨酸，其余可以生产的品种有苏氨酸、异亮氨酸、结氨酸、精氨酸。组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等。,1、直接发酵法,（八）、氨基酸的化学合成,又称为微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质，以避免氨基酸合成途径的反馈抑制作用，经微生物作用将其有效地转化为目的氨基酸。目前成功地用邻氨基苯甲酸作为前体，工业生产色氨酸；用甘氨酸作为前体工业化生产丝氨酸。,2添加前体发酵法,（八）、氨基酸的化学合成,用微生物产生的酶作催化剂，直接使底物转化为目标氨基酸。具有工艺简单，周期短、耗能低、专一性强、收率高等特点。,3、酶法,（八）、氨基酸的化学合成,反丁烯二酸 NH3 L-天冬氨酸,3、酶法,天冬氨酸酶,（八）、氨基酸的化学合成,L-天冬氨酸 H2OL-丙氨酸CO2,3、酶法,天冬氨酸-脱羧酶,（八）、氨基酸的化学合成,-氯-L-丙氨酸H2S-L-半胱氨酸HCl,3、酶法,半胱氨酸脱硫基酶,（八）、氨基酸的化学合成,甘氨酸 甲醛-L-丝氨酸,3、酶法,丝氨酸转羟甲基酶,（八）、氨基酸的化学合成,甘氨酸 乙醛 L-苏氨酸,3、酶法,苏氨酸醛缩酶,（八）、氨基酸的化学合成,醛与氢氰酸和氨反应得到氰氨化物，经水解得到外消旋的氨基酸。,4.化学合成法,（1）Strecker合成法,（八）、氨基酸的化学合成,-酮酸与氨作用，生成亚胺，再还原成外消旋的氨基酸。,4.化学合成法,（2）还原氨化法,（八）、氨基酸的化学合成,此法是先制得-溴代羧酸，再在封管内或高压釜内和氨气反应得到外消旋氨基酸。,4.化学合成法,（3）-溴代羧酸氨化法,（八）、氨基酸的化学合成,丙二酸酯经亚硝化、催化氢化得到乙酰氨基丙二酸酯。在不同反应条件下，可以进一步得到各种氨基酸,4、化学合成法,（4）丙二酸酯合成法 a.乙酰氨基丙二酸酯合成法,（八）、氨基酸的化学合成,丙二酸酯溴化后与邻苯二甲酰亚胺钾反应得到邻苯二甲酰亚胺基丙二酸酯。它作为中间体，可以进一步与多种试剂发生反应制得不同的氨基酸,4.化学合成法,（4）丙二酸酯合成法B.溴代丙二酸酯合成法,（八）、氨基酸的化学合成,通常可以使消旋体与一个具有光学活性的化合物反应得到非对映体，然后利用二者的物理或化学性质的不同进行分离。常用的光学活性化合物有生物碱（如马钱子碱）或有机酸（如酒石酸）等。L-氨基酸+纯手性碱（或酸）L-氨基酸盐 分离D-氨基酸 D-氨基酸盐,5.外消旋氨基酸的拆分,(1)化学法,（八）、氨基酸的化学合成,5.外消旋氨基酸的拆分,（2）酶解法,（八）、氨基酸的化学合成,不对称加成途径通过加成试剂（一般是加氢）的选择性加成而实现的合成途径,例如Corey法合成手性纯氨基酸,6氨基酸的不对称合成,（1）应用不对称前体合成法,（八）、氨基酸的化学合成,不对称取代途径通过试剂（一般是烷基化）的选择性取代而实现的合成途径,6氨基酸的不对称合成,（1）应用不对称前体合成法,（八）、氨基酸的化学合成,此法的关键是制备一种具有特殊空间结构的加氢催化剂，这种催化剂能够识别底物分子的潜手性面，使氢原子只能从一个方向进行加成，得到光学纯异构体。,6氨基酸的不对称合成,（2）应用不对称催化剂合成法,（八）、氨基酸的化学合成,反应基本过程,6氨基酸的不对称合成,（2）应用不对称催化剂合成法,（九）氨基酸的应用,1、医药工业 氨基酸输液 必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。,治疗药剂,1，精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；2，天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。3，半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,2、化学工业,维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,3、食品工业,营养强化剂；谷氨酸钠味精；天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM,4、农业,杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,5、化妆品工业,氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。,返回,第四章、蛋白质的结构,一、肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,structure,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,(一）、肽键及肽平面,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。,1、肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,2、肽的结构,肽的二面角,3、天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为 Orn）。,二、蛋白质的一级结构,（一）、蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,蛋白质和肽的区别,1、蛋白质分子量大（最小为5700道尔顿）2、蛋白质为直链分子，肽可以是直链分子，也可以是分支分子，也可以是环状分子。3、蛋白质在溶液中构象稳定，肽在溶液中有构象漂移现象。4、蛋白质分子中仅含L-氨基酸，而肽中D-含氨基酸。,（二）、蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。蛋白质一级结构的测定的战略：片段重叠法,(1)、样品必需纯（97%以上）；(2)、知道蛋白质的分子量；(3)、知道蛋白质由几个亚基组成；(4)、测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。(5)、测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,1、测定蛋白质一级结构的要求,2、测定步骤,(1)、多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,2、测定步骤,(1)、多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,(1)、多肽链的拆分,几条多肽链借助共价键连接在一起，如：胰岛素，可用过甲酸氧化法或-巯基乙醇还原法。,2、测定步骤,(2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,2、测定步骤,(3)、二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,2、测定步骤,可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,1,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,(4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,2、测定步骤,(5)、分析多肽链的N-末端和C-末端。,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,(6)末端基氨基酸测定,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,(6)末端基氨基酸测定,、二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,(6)末端基氨基酸测定,、丹磺酰氯法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,(6)末端基氨基酸测定,、肼解法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,(6)末端基氨基酸测定,、氨肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,(6)末端基氨基酸测定,、羧肽酶法,2、测定步骤,(7)、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,、酶解法:胰蛋白酶 水解Lys Arg羧基形成的肽键。糜蛋白酶 水解Tyr Phe Trp羧基形成的肽键。胃蛋白酶 水解肽键的两侧AA均为疏水性AA.金黄色葡萄球菌菌蛋白酶 水解Glu Asp羧基形成的肽键。梭状芽孢杆菌蛋白酶 水解Arg羧基形成的肽键。羧肽酶 从羧基端开始逐一水解AA的酶氨肽酶 从氨基端开始逐一水解AA的酶,(7)多肽链的选择性降解,、化学法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,(7)多肽链的选择性降解,2、测定步骤,(8)、测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,(8)Edman氨基酸顺序分析法,2、一般测定步骤,(9)、确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,2、一般测定步骤,(9)、确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,(10)二硫键位置的确定,第五章、蛋白质空间结构一、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链(骨架链)在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角、随机卷曲。,（一）蛋白质的二级结构,1、-螺旋-helix,在-螺旋中肽平面的键长和键角一定；肽键的原子排列呈反式构型；相邻的肽平面构成两面角；,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。,（1）、-螺旋,-螺旋,（2）、稳定-螺旋的力,氢键,第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。,（3）-螺旋的类型,左手-螺旋 右手-螺旋,Pauling预测的三种螺旋结构,3.010 helix,16 helix,helix,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,2、-折叠,（1）、反平行折叠,(2)、平行折叠,（3）、维持折叠的力,氢键：折叠允许所有的氨基氢和羰基氧之间形成氢键。,3、-转角-turn,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,4、随机卷曲,随机卷曲也称无规卷曲，人们尚 未 未发现其规律，但随机卷曲往往和蛋白质的功能有关,四、超二级结构的类型,超二级结构 蛋白质多肽链一级结构中相邻的二级结构在形成空间结构时彼此靠近，形成二级结构的聚集体。主要有以下几种类型、：,1、在蛋白质中(Rossmann折叠),-sheet 模式之一,折叠在蛋白质中的不同形式,-sheet模式之一,-sheet 模式之二,-sheet 模式之三,2、结构域(domain)在空间上相对独立,免疫球蛋白,蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域,二蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。,血红蛋白的三级结构,血红蛋白由一条153个氨基酸组成的肽链和一个血红素辅基组成。分子量为17800。二级结构形成八段螺旋，分别为A、B、C、D、E、F、G、H，每段螺旋包含7-8个氨基酸，最长的有23个氨基酸。E7（第64His）和F8（第93His）和血红素连接。形成一个致密的球状结构。疏水AA位于分子内部，亲水AA位于分子表面。,三、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位（Subunit），它一般由一条肽链构成，无生理活性；维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；,1、四级结构的结构模型,2、四级缔合在结构和功能上的优越性,增强结构的稳定性提高遗传经济性和效率使催化基团汇集在一起具有协同性和别构效应,两个亚基的结构,返回,作用力 破坏因子氢键：-螺旋，-折叠 尿素，盐酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂Van der Waals力：稳定紧密堆积的集团和原子离子键：稳定-螺旋，三、四级结构 酸、碱二硫键：稳定三、四级结构 还原剂配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA,四、维持蛋白质空间构象的作用力,H2NC(:NH)NH2 HCl,稳定蛋白质的作用力,1、共价键,蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。,2、非共价键,生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。,1)、静电作用,静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用,（1)离子键,生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。,(2)离子偶极作用,药物分子和受体分子中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用.离子-偶极相互作用一般比离子键小得多，键能与距离的平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响药物-受体的作用强度。如普鲁卡因及其衍生物的局部麻醉作用与酯羰基的偶极性质有关。,(3)偶极-偶极相互作用,两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。偶极偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用强度比离子偶极作用小，但比偶极诱导偶极作用大。这种作用对药物受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要,2)、氢键,氢键的形成 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。氢键的大小和方向 氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为8.433.4kj/mol(2-8kcal/mol)。键长为0.250.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，是指XH与HY之间的夹角，一般为180250。,3).范德华力,这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.40.6nm(46A)时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力，其中作用势能与1/R6成正比的三种作用力（静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。,4)、疏水作用,疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。,返回,第六章、几种重要的蛋白质类型,一纤维状蛋白 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外保护成分，占脊推动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于1()(小于：10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肤链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。,二、纤维状蛋白质的类型,纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性二类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)、肌动蛋白细丝(actin filament)或鞭毛(flagella)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。,1、角蛋白 Keratin,角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。-角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手-螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。-角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度-拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白。,毛发的结构,一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。毛发性能就决定于螺旋结构以及这样的组织方式。,角蛋白分子中的二硫键,卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，此外角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,2、-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。它具有0.7nm周期，这与角蛋白在湿热中伸展后形成的角蛋白很相似(0.65nm周期)。丝心蛋白是典型的反平行式公折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的C为侧链腾出空间，从而避免了任何空间位阻。在这种结构中，侧链交替地分布在折叠片的两侧。,丝蛋白的结构,丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-,3、肌球蛋白和肌动蛋白,肌肉的构成,骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕的“螺旋肽链的尾巴和一个复杂的“头”。它的总分子量为450000，约160nm长，实际上含有六条肽链。长尾巴是由二条分子量各为200000的肽链组成，这两条肽链称为重链(heavy chain H链)。重链具有柔软的可转动铰链。头是球形的，含有重链的末端和四条轻链(light chain，L链)，其中两条称作L2，分子量为18000，另外两条称为Ll和L3,分子量分别为16000和25000。肌球蛋白分子的头部具有酶活性，催化ATP水解成ADP和磷酸，并释放能量。许多肌球蛋白分子装配在一起形成骨骼肌的粗丝(thick filament)。肌球蛋白也存在于非肌肉细胞内。,在骨骼肌中与粗丝紧密缔合在一起的是细丝(thin filament)，它由肌动蛋白组成。肌动蛋白以两种形式存在，球状肌