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EBV LMP2 B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究,温州医学院2004级硕士学位论文答辩,答辩人：欧 琴导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授专 业：病原生物学,主 要 内 容,研究背景 研究目的 研究方案 结 果 分析与讨论 结 论,研 究 背 景,EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)属于疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。,研 究 背 景,肿瘤 亚型 EBV阳性率,表1 EBV相关的增生性疾病,Burkitt淋巴瘤 E-BL 100%S-BL 15%-85%AIDS-BL 100%NPC 低分化或未分化 100霍奇金病 mc/ld 80%-90%ns 30T细胞淋巴瘤 fatal IM 100%AILD 40%淋巴母细胞瘤 fatal IM 100%与器官移植相关 100 与AIDS相关 70-80%,研 究 背 景,LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。,研 究 背 景,表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。,研 究 背 景,NPC患者血清中能检测LMP2抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。,研 究 目 的,1.预测EBV LMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。2.分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。3.将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。,研 究 方 案,一、EBV LMP2的二级结构分析和B细胞表位预测,研 究 方 案,采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列(http:/);采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法预测LMP2二级结构(http:/tools)；采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域(http:/tools)；采用EXPASY服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数()；对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并用吴玉章等建立的抗原性指数(AI)综合评判EBV LMP2的B细胞优势表位。,研 究 方 案,二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化,研 究 方 案,引物设计与合成,退火获得目的基因,pET32a(+)/EBV-LMP2 B细胞表位重组质粒的构建,纯化、连接、转化DH5大肠杆菌,转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白,SDS-PAGE、Western blot分析,pET32a(+)质粒酶切,酶切、测序鉴定,研 究 方 案,引物 碱基序列 酶切位点,OZLF-67 5TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAA BamHI AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3OZLF-68 5GATCCCGCATCGAAGATCCGCC XhoI CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3 OZLF-69 5TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3 BamHI OZLF-70 5GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3 XhoI OZLF-71 5TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC BamHI TGTGCTGGACAATGATTTG 3 OZLF-72 5GATCCAAATCATTGTCCAGCACA XhoI GAATTTATCCCGAATTAAC 3,图1 pET32a/B细胞表位的重组质粒图,研 究 方 案,研 究 方 案,层析纯化蛋白：,灌 胶,Buffer B液调节吸光度和透光度,样本处理,样本加入层析柱中，收集滤液,Buffer B液洗涤，至A0.01，收集滤液,Buffer D液洗涤，至A0.01，收集滤液,Buffer E液洗涤，至A0.01，收集滤液,样本收集,SDS-PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况,Buffer B:8M尿素(pH8.0)Buffer D:8M尿素(pH6.8)Buffer E:8M尿素(pH4.0),研 究 方 案,三、EBV LMP2 B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究及血清学检测,研 究 方 案,动物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多点注射采血方式：眶静脉采血，3只/组,研 究 方 案,ELISA检测：,以纯化的融合蛋白作包被抗原以B95.8细胞作包被抗原选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体,结 果,一、EBV LMP2的二级结构 分析和B细胞表位预测,结 果,H:-螺旋；e:-片层；c:无规卷曲；-:未预测结构；t:-转角 图2 EBV LMP2二级结构预测,结 果,aa 144150 202208 265268 318322 375390 445455,图2 按SOSUI程序预测EBV LMP2蛋白跨膜区,膜内区域,跨膜区,膜外区域,结 果,图3 各种不同参数对EBV LMP2的预测结果,a.亲水性参数 b.极性参数 c.柔韧性参数,d.表面可及性 e.抗原性,二级结构 1082,89108,116126,142149,198206,288295,317321,339348,379389,414422,481497 膜外区域 144150,202208,265268,318322,375390,445455 亲水性 1526,3641,4360,6574,9096,101119,176179,199205,236242,414416,483492 表面可及性 1318,2022,2532,3964,6782,9092,95112,114116,73 178 199201,203204,235240,378380,383384,416 420,484 496 抗原性 1083,88109,111121,174179,198207,235241,290293,340 348,380387,413421,471476,483491 极性 2023,4555,5759,6574,9094,102117,198203,234342,483491 柔韧性 1085,89121,199205,218222,236244,289296,342347,370 378,381383,385388,412420,483493,预测方法 预测结果,结 果,表3 应用不同方法预测EBV LMP2 蛋白B细胞表位的肽段位置,结 果,145150 TASVST 0.005 199209 RIEDPPFNSLL 0.037 318322 TLNLT 0.036 381391 KSLSSTEFIPN 0.028,B细胞表位区域 氨基酸序列 抗原性指数,表4 EBV LMP2的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数,二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化,结 果,结 果,图4 重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I,重组质粒酶切鉴定,结 果,测序结果,图7 3个重组的目的基因的测序图,结 果,B细胞表位融合蛋白鉴定,图8 B细胞表位融合蛋白表达产物SDS-PAGE和Western-Blot分析1:蛋白分子标准物；2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达；6:BL21,结 果,ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化,图9 纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；4：Buffer C液滤液；5-7：Buffer E液滤液,图10 纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；4：Buffer C液滤液；5-8：Buffer E液滤液,图11 纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；4：Buffer C液滤液；5-6：Buffer E液滤液,图12 纯化的His蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；4：Buffer C液滤液；5：Buffer E液滤液,结 果,结 果,三、EBV LMP2 B细胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究,结 果,图13 不同免疫原在不同时间的抗体均值（XSD）,分别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效价差异。,结 果,图14 多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果,*,*：与His蛋白免疫组比较,*,*,结 果,B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融合蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。,图15 B95.8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价,*：与His蛋白免疫组比较,*,*,*,结 果,选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。,图16 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价,*：与正常组比较,*,结 果,表5 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率,*,*与正常组比较,*,分 析 与 讨 论,预测的B 细胞表位是线性B 细胞表位，主要的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种因素综合作用的结果。,分 析 与 讨 论,采用分子生物学方法分别得到了包含预测表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。,分 析 与 讨 论,3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体以B95.8细胞作为抗原包被酶标板，B细胞表位 融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位 肽的结合能力较弱。,分 析 与 讨 论,选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。,结 论,1.预测EBV LMP2的B细胞表位可能位于其N端199209、318322和381391区段；2.分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。3.表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合。4.Ozlf67蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。,首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚 挚的敬意和感谢！感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台 全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学等对我实验的帮助及生活的关心！我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生感激！最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家教授在百忙之中对本文的指导！,致 谢,谢谢！,