发酵工程第十三章发酵产物分离原理与技术.ppt

第十三章 发酵产物分离原理与技术,发酵产物分离原理与技术,第一节 沉淀分离法第二节 吸附和树脂分离法第三节 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法第四节 萃取与浸取分离法第五节 膜分离技术,第一节 沉淀分离法,沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。沉淀法方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段。沉淀法的分类：等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法生成盐复合物沉淀法热变性及酸碱变性沉淀法,一、等电点沉淀法,原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低；优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许；缺点：酸化时易引起蛋白失活。,不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛素的等电点为5.3，在与Zn2+结合形成胰岛素锌盐，其等电点升为6.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要注意调整pH。,等电点沉淀法的实例,从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入2040%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。,等电点沉淀法,等电点沉淀法的适用范围：明确pI的两性物质；疏水性较大的蛋白质。,二、盐析法,蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。盐析法的原理盐析法的影响因素,1、盐析法的原理,原理：盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。,盐析原理示意图,盐析原理,图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图,蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用Cohn方程式表示：logS/S0=KsI logS=-KsI S 离子强度为I时的蛋白溶解度(g/L);S0 纯溶剂（即I=0）时蛋白的溶解度；Ks 盐析常数，与温度和pH无关；I 离子强度 当温度一定时，S0对于某一溶质是一常数，即logS0=是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种类无关。,盐析法原理,盐析法分离蛋白质时，可分两类：1）在一定的pH值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法“K”分级盐析法2）在一定离子强度下，改变溶液的pH值及温度的沉淀方法“”分级盐析法,2、盐析的主要影响因素,盐溶(salting in)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对Ks值的影响，Ks值越大，该盐的盐析效果越好。,1）蛋白质浓度,高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻,2）离子强度和种类,3）温度,温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小 这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。,4）pH,值除与蛋白质和温度有关外，还与pH有关；盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pH,几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离子的强度,不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系,不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25）()NaCl;()KCl;()MgSO4;()（NH4)2SO4;()Na2SO4;()K2SO4;()柠檬酸三钠,温度和pH值的影响,温度对碳氧血红蛋白盐析曲线的影响,pH值对的影响,三、有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀法的原理有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的优缺点有机溶剂沉淀法的注意事项有机溶剂沉淀法举例,1、有机溶剂沉淀法的原理,许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降低水溶液的介电常数。当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸引力增大，带电溶质互相吸引而聚集。对于具有表面水层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而相互聚集析出。不同浓度的有机溶剂可使不同的溶质沉淀，即分步沉淀法，达到分离纯化的目的。,蛋白质分子表面,用于生物物质沉淀的有机溶剂须能与水互溶，但对蛋白无作用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖类、氨基酸和核苷酸等物质最常用的沉淀剂；在沉淀过程中，乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，这对热稳定性较差的产物影响较大（少量多次、搅拌）,1）有机溶剂的种类,2）温度,多数生物物质在有机溶剂与水的混合液中的溶解度是随温度的降低而降低的，因此降低温度可增加收率；低温沉淀还能更好地保护生物物质的活性,3）pH,在结构稳定范围内，选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果；在接近等电点处，引起沉淀所需有机溶剂的量最小；合适的pH还可大大提高分离的分辨能力,4）样品浓度和分子质量,低浓度样品需要使用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低；高浓度样品使用有机溶剂的量较小，减少了变性的危险；但共沉作用大，分离效果较差。蛋白质分子质量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。,5）金属离子和离子强度,Mn 2+、Fe 2+、Co 2+、Cu 2+、Zn 2+等离子能与蛋白质的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合；Ca 2+、Ba 2+、Mg 2+、Pb 2+能与羧基结合；Ag+、Hg 2+、Pb 2+能与巯基结合形成复合物；某些有机化合物能与生物大分子形成难溶复合物.这类复合物在水或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的生物活性，同时还能降低有机溶剂的用量。,2、有机溶剂沉淀法的影响因素,3、有机溶剂沉淀法的优缺点,优点：分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀无需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，易进行固液分离；有机溶剂易挥发，不会在成品中残留。缺点：易引起蛋白变性；易燃、易爆,4、有机溶剂沉淀法的注意事项,（1）降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性。（2）所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不起作用。（3）蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。（4）一种蛋白质的溶解度通常会由于另一蛋白质的存在而降低。（5）沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。（6）对很多酶，丙酮加量在20%50%之间，就能产生沉淀。（7）接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。（8）当溶剂量达到50%时，则通常只有分子量小于15000的蛋白质仍留在溶液中。（9）少量中性盐的存在能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶剂水溶液的溶解度。,5、有机溶剂沉淀法举例,四、非离子型聚合物沉淀法,聚乙二醇(PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等 沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯化。机制：可能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生物大分子形成复合物；或通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫聚集而沉淀。常用PEG6000-20000；PEG的沉淀效果除与沉淀剂的浓度有关外，还受离子强度、pH和温度的影响,五、聚电解质沉淀法,离子型的多糖化合物：酸性多糖用的较多，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶等 阴离子聚合物：如聚丙烯酸 阳离子聚合物：如聚乙烯亚胺等 可沉淀蛋白，作用方式类似于絮凝剂，兼有一定的盐析和水化作用,发酵产物分离原理与技术,第一节 沉淀分离法第二节 吸附和树脂分离法第三节 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法第四节 萃取与浸取分离法第五节 膜分离技术,第二节 吸附和树脂分离法,吸附：是溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附剂：吸附操作使用的固体，一般为多孔微粒，具有很大的比表面积，这类物质就是吸附剂。吸附法的优缺点吸附原理和吸附剂种类活性炭和离子交换树脂吸附脱色树脂法原理和树脂分类,一、吸附法的优缺点,优点：可不用或少用有机溶剂；操作简单、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性差的生化物质。缺点：选择性差、收率不太高、特别是无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大，有些不环保。,二、吸附原理和吸附剂种类,吸附的原理吸附剂的种类,1、吸附的原理,固体表面的分子或原子与液体表面分子一样，处于特殊的状态，具有不饱和的剩余力，即存在着表面力，所以他们能够吸附外界物质，使这些外界物质在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层，从而降低表面能，使自身达到稳定状态。吸附作用是一组分子引力的总称：定向力、诱导力和色散力。一般多孔性固体才能作为吸附剂使用。吸附的分类影响吸附的因素,吸附的分类,物理吸附 吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。化学吸附 化学吸附是由于吸附剂与吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力范围。交换吸附 吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。,影响吸附的因素,吸附剂的性质：吸附剂的理化性质对吸附的影响很大；吸附物的性质；溶液的pH值：影响化合物的解离程度；吸附过程的温度：吸附热越大，温度影响越大；其他组分的影响：含有两种或以上的组分的溶液，其他组分会影响吸附效果。,2、吸附剂的种类,吸附剂的要求疏水性或非极性吸附剂亲水性或极性吸附剂各种离子交换树脂吸附剂,、吸附剂的要求,吸附剂不能溶于操作的溶液中；吸附剂本身是一种多细孔粉末状物质，颗粒密度小，表面积大，但孔隙也不要太多，否则溶质不容易被解吸；吸附剂必须颗粒大小均匀；吸附能力大，容易被洗脱。,、疏水性或非极性吸附剂,适用于极性溶媒内吸附物质，典型的吸附剂是活性炭。活性炭：容易从水溶液中吸附溶质，吸附芳香族化合物能力大。活性炭种类：有酸性、碱性或中性。活性炭吸附选择性差，不能进行精炼。,活性炭种类,粉末活性炭,锦纶活性炭,亲水性或极性吸附剂,适用于非极性或极性较小的溶媒，如硅胶、氧化铝、活性土。氧化铝为常用的亲水吸附剂，属于无机离子交换剂，常用于色层分离；具有离子交换剂的性质。氧化铝选择性较差。,、各种离子交换树脂吸附剂,各种有机离子交换树脂也是属于极性吸附剂，因为是两性化合物，可以进行离子交换，所以也叫离子交换树脂。常用于发酵产品脱色和分离杂质。,三、活性炭和离子交换树脂吸附脱色,活性炭吸附脱色离子交换树脂脱色,1、活性炭吸附脱色,发酵工业生产中常用活性炭对发酵产品进行吸附脱色，例如：味精溶液脱色。味精溶液脱色：活性炭pH为5.0左右。强化加入硫化钠溶液。波美度：（B）是表示溶液浓度的一种方法。把波美比重计浸入所测溶液中，得到的度数叫波美度。不同溶液的波美度的测定方法是相似的，都是用测定比重的方法，根据测得的比重，查表换算浓度。,2、离子交换树脂脱色,原理：靠树脂的多孔隙表面对色素进行吸附作用，树脂的基团与色素的某些基团形成共价键，也有交换作用。,脱色常用的离子交换树脂：大孔717#强碱性季胺型树脂及多孔弱碱专390#苯乙烯伯胺型弱碱性阴离子交换树脂。,味精离子交换树脂脱色工艺,预处理及转型：4%氢氧化钠溶液去杂质，洗至pH8，4%盐酸转型，无离子水洗至流出溶液pH7左右，用5%氯化钠溶液洗至进出液pH相同；上柱脱色及水洗：中和液23 B低流速上柱，上柱完毕后用热水洗至流出液0 B以下。再生：用10%氯化钠+10%氢氧化钠混合液再生，水洗至pH8，无离子水洗至进出液氯离子含量相同，调pH6.4，再用5%氯化钠洗至进出液pH相同；上液量：717型为树脂体积的60倍，390型为树脂体积10倍以上。,四、树脂法原理和树脂分类,树脂法原理树脂分类吸附树脂分离维生素,1、树脂法原理,高分子吸附剂是一种利用离子交换树脂，采用不同方法去掉其上的功能基团，保留多孔骨架，依据树脂骨架和溶液分子间的分子吸附（并不发生离子交换）原理而设计的一类吸附剂，也叫吸附树脂。吸附树脂本身以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物，而构成它的一个重要方面是各种不同的表面物质。吸附树脂的吸附能力不但与吸附剂的化学结构和物理性能有关，而且与溶质和溶液的性质有关。,2、树脂分类,按链节分子结构：非极性、中等极性和极性；吸附树脂命名不规范；吸附树脂属于热固性聚合物，加热不熔，150内均可使用，不溶于溶剂和酸碱。结构特点：比表面积、孔径都很大，可以人为调节。,吸附树脂分离维生素,维生素B12是抗生素生产的副产品，一般用羧酸型离子交换树脂回收维生素B12。实际上证明用大网格聚合物吸附剂提取效果更好。大孔吸附树脂（大网格吸附树脂）目前应用广泛，不仅用于维生素B12的吸附分离，而且很多药物提取也经常使用，如中草药的提取分离等。,发酵产物分离原理与技术,第一节 沉淀分离法第二节 吸附和树脂分离法第三节 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法第四节 萃取与浸取分离法第五节 膜分离技术,第三节 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法,离子交换法原理和离子交换树脂的结构与分类离子交换法提取卡那霉素离子交换膜电渗析法的基本原理和流程,一、离子交换法原理和离子交换树脂的结构与分类,离子交换法的基本原理离子交换树脂的结构与分类离子交换树脂的主要性能,1、离子交换法的基本原理,离子交换法的基本原理：一定条件下离子交换反应的方向和限度，这就是离子交换平衡的问题，即离子交换热力学；离子交换反应的历程和达到平衡的时间，这就是离子交换速率的问题，即离子交换动力学。,离子交换平衡,离子交换反应是可逆反应，溶液和树脂中的离子之间浓度差推动他们之间的交换，浓度差越大，交换速率就越快，达到一定程度则形成离子交换平衡状态。这时树脂和溶液中同时具有两种离子。如用化学反应解释，则可以用基本的质量作用定律描述离子在树脂相和溶液相之间的分配。,离子交换速率,离子交换反应在动态下进行，因此，离子交换的效果除受离子浓度和选择系数的影响外，还要受离子从溶液中进入树脂表面和在树脂内部的扩散过程的影响，这个影响因素就是离子交换速率的影响。举例：以Na型树脂与溶液中Ca2+进行交换为例，即表示单位时间内，溶液中的Ca2+浓度减少或Na+浓度增加量。,组成因素为：Ca2+离子从溶液通过树脂表面的液膜或边界层，达到树脂表面；Ca2+离子从树脂表面向孔道中迁移，并达到有效交换位置；在交换点上两种离子进行交换反应；钠离子从树脂内部迁移到树脂表面；钠离子穿过树脂表面的液膜进入水溶液中。,离子交换速率,在上述过程中，液膜扩散和粒内扩散速率控制着离子交换速率。而这两个速率也受到多种因素影响，如：溶液流速：膜扩散随过柱流速的增加而增加，粒内扩散则不受其影响；树脂颗粒：离子的液膜扩散速率与树脂颗粒大小成反比，而粒内速率则与粒径倒数的高次方成正比；溶液浓度：溶液中离子浓度较低，则对液膜速率影响较大，对粒内速率影响较小，反之则液膜速率影响小而粒内速率影响大。,离子交换速率,2、离子交换树脂的分类,其活性基团一般是磺酸基(-SO3H);由于是强酸性基团，电离程度不受外界pH的影响，在pH1-14范围内均能起交换作用，一般没有使用pH的限制。以与NaCl的交换为例：R-SO3H+NaCl R-SO3Na+HCl 其再生是用NaOH处理并水洗至pH8-9。再用HCl处理并用水洗至pH5,、强酸性阳离子交换树脂,、弱酸性阳离子树脂,以羧基(-COOH)、酚羟基(-OH)等为活性基团；其交换性能与溶液的pH有很大关系，因为这种树脂的电离度很小。例如：羧基树脂交换pH7，酚羟基树脂交换pH9。在酸性溶液中，这类树脂几乎不发生交换反应，其交换能力随溶液pH增高而增高。典型交换反应：R-COOH+NaOH RCOONa+H2O 反应生成的盐RCOONa很容易水解并使溶液呈碱性，故钠型树脂不可能水洗到中性，一般只能水洗到pH8-9。,、强碱性阴离子交换树脂,有两种：强碱型 含有三甲胺基 强碱型 含有二甲基-羟基-乙基胺 型比型的碱性强，但再生困难；型的稳定性则较差；强碱性阴离子交换树脂与强酸性阳离子交换树脂一样，没有使用pH的限制；典型交换反应：RN(CH3)3Cl+NaOH RN(CH3)3OH+NaCl,、弱碱性阴离子交换树脂,活性基团有伯胺基-NH2、仲胺基NH、叔胺基NH和吡啶基等；与弱酸性阳离子树脂情况类似，交换能力随pH的变化而变化，pH越低，交换能力越大；典型交换反应：RNH3OH+HCl RNH3Cl+H2O 生成的盐RNH3Cl很容易水解；这类树脂与OH的结合能力较强，容易再生成羟型，耗碱量也少。,另有一些特殊的树脂，如鳌合树脂、两性树脂、氧化还原树脂；大孔树脂,3、离子交换树脂的主要性能,颗粒与形状,交联度,膨胀度,稳定性,交换容量,树脂的颗粒大小，对树脂交换能力，树脂层中溶液流动分步均匀程度，溶液通过树脂层压力以及交换和反洗时树脂的流失等都有很大影响。,合成树脂时单体中交联剂（二乙烯苯）含量百分数叫交联度。通常8%-12%；一般交联度越大，树脂越坚固，机械强度越好，在水中不易膨胀；交联度越低，树脂越柔软，越容易膨胀，越能很好地吸附较大的离子，达到交换平衡的速度越大；但机械强度差，吸附的选择性小；,树脂不溶于水，但亲水性强，具有亲水胶体性质，一般吸水膨胀，脱水收缩；测定方法：将10-15ml风干树脂放入量筒，加入欲实验的溶剂（多为水），然后不时摇动，24h后，测定树脂的体积。前后体积之比称为膨胀系数；膨胀系数与交联度有一定关系，交联度大的树脂膨胀系数小；,选用耐温、耐磨、耐酸碱和不易破碎的交换树脂可以保证循环使用的次数。,指一定量树脂中可交换基团的毫克当量数，是表征树脂性能的重要指标。若将树脂装柱进行操作，流出液中产物离子达到某一浓度时，操作即应停止，树脂进行再生后再使用。这一浓度称为漏出点。在漏出点时树脂所吸附的量叫做工作交换容量。,二、离子交换法提取卡那霉素,提取原则和策略卡那霉素性质树脂类型溶液pH操作方式动态串联方式,卡那霉素提取的原则和策略,提取原则：采用对卡那霉素亲和力强的树脂，进行富集提取策略：卡那霉素理化性质：结构、pKa值、价态 树脂筛选：强酸型、弱酸型 条件选择：溶液pH值、卡那霉素浓度、操作方式,图1 卡A:R1=OH R2=NH2 C18H36N4O11 MW=484.499 D=+146 卡B:R1=NH2 R2=NH2 C18H37N5O10 MW=483.54 D=+130 卡C:R1=NH2 R2=OH C18H36N4O11 MW=484.499 D=+126,卡那霉素结构式,卡那霉素性质,强酸型阳树脂（如732）;弱酸型阳树脂（如DK110、D186、HZ-I）,树脂类型,溶液的pH值,合适的pH值必须达到下列条件：使卡那霉素能解离使732或DK110能离子化卡那霉素能维持在稳定的范围内,卡那解离问题,当PH7.0时在PH5.0时当PH9.0时,卡那霉素离解常数（pKa值）,卡那霉素离解曲线,树脂解离问题,-SO3H型732树脂pK1-COOH型DK110 pK 46,卡那稳定性问题,卡那稳定存在的pH=68。732树脂离子交换时溶液pH=5.56.0；DK110树脂离子交换时，溶液pH=6.87.2。,原液浓度,卡那是多元有机生物碱离子交换理论分析发酵水平,操作方式,国内沿用732静态吸附，3%NH4OH动态洗脱法；国外采用DK110动态吸附，2%NH4OH动态解吸法,动态串联方式,三、离子交换膜电渗析法的基本原理和流程,基本原理：该方法是膜分离技术的一种，是在直流电场作用下，以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择渗透性，把电解质从溶液中分离出来，从而实现溶液的淡化、浓缩、精制或纯化的目的。基本流程：技术关键是采用离子交换膜，是具有离子交换基团的网状立体结构的高分子膜，离子可以选择性通过膜。选择好膜之后，通入直流电，使溶液中带电离子沿一定方向迁移穿过膜，达到效果。,发酵产物分离原理与技术,第一节 沉淀分离法第二节 吸附和树脂分离法第三节 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法第四节 萃取与浸取分离法第五节 膜分离技术,第四节 萃取与浸取分离法,溶剂萃取法浸取超临界流体萃取技术双水相萃取技术反胶团萃取技术,一、溶剂萃取法,利用溶质组分在两个互不混溶的液相中竞争性溶解和发你配性质上的差异来进行分离操作。溶剂萃取法的优点溶剂萃取过程的理论基础工业萃取方式和理论收得率乳化和去乳化,1、溶剂萃取法的优点,萃取过程具有选择性；能与其他需要的纯化步骤相配合；通过转移到具有不同物理或化学特性的第二相中，减少由于降解引起的产品损失；可从潜伏的降解过程中分离产物；适用于各种不同的规模；传质速度快，生产周期短，便于连续操作，容易实现计算机控制。,二、溶剂萃取过程的理论基础,溶剂萃取的目标是将目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。物质的溶解和相似相溶原理溶剂的互溶性规律溶剂的极性分配定律和分离因数水相条件的影响,溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理，达到将不同物质分离纯化的目的。,物质的溶解和相似相溶原理,溶质溶解的的过滤目前用相似相溶原理解释，即分子间结构的相似和能量的相似导致溶解。,溶剂的互溶性规律,按照形成氢键能力，将溶剂分为四种类型：N型溶剂，不能形成氢键；A型溶剂，只有电子受体的溶剂；B型溶剂，只有电子供体的溶剂；AB型溶剂，同时具备电子受体和供体；,溶剂的极性,发酵工业上对分子间作用能相似考虑很多，即考虑较多的是分子极性。溶剂选择时，应根据目标产物的介电常数，寻找极性相接近的溶剂作为萃取溶剂。良好溶剂的要求,良好溶剂的要求,有很大的萃取容量；有良好的选择性；与被萃取的液相互溶度要小，利于两相分离；溶剂的回收和再生容易；化学稳定性好，不易分解；经济性能好，价廉易得；安全性好，沸点高，对人体无毒害作用。常用溶剂：酯类、醇类和酮类。,分配定律和分离因数,料液（F）、溶质、萃取剂（S）、萃取液（L）和萃取余液（R）。分配定律：在一定温度和压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，它在良乡的浓度比为一个常数K，通常叫分配常数。分配常数的大小反映出溶质在不同溶剂中溶解度的差异以及在此系统中的选择性。,分离因素（分离系数）：若在同一体系中有两种溶质A和B，它们在相同条件下的分配常数分别为KA、KB，则分离系数的定义为：=KA/KB=(CLA/CRA)/(CLB/CRB),水相条件的影响,由于产物所在的发酵液或水相中往往还存在与产物性质相近的杂志，未完全利用的底物、无机盐、供微生物生长代谢的其他营养成分等，必须考虑这些因素对萃取的影响。pH值温度盐析带溶剂：能和产物形成复合物，使产物更容易进入有机溶剂中，该复合物在一定条件下能容易分解。,3、工业萃取方式和理论收得率,工业萃取的过程包括：混合、分离和溶剂回收。萃取方式：单级萃取,使用一个混合器和一个分离器的萃取操作。F和S在混合器内混合萃取，达到平衡后的溶液送到分离器内，得到L和R，L送至回收器，R为废液。,多级错流萃取,由几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个相；萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收器回收溶剂，回收得到的溶剂仍作萃取剂循环使用。,多级逆流萃取,多级逆流萃取包括若干萃取级，在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故得名。,4、乳化和去乳化,乳化：是一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带现象：一是发酵液提取废液中夹带有机溶剂微粒，导致产品损失；二是有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。乳化形成两种乳浊液：水包油型和油包水型。,乳液的示意图,1）离心分离法,2）提高温度,提高温度可使黏度下降，使乳浊液稳定性降低,3）稀释法,4）电解质破乳法,5）吸附法,6）顶替法,7）转型法,去乳化方法,加入表面活性更强但不能形成保护膜的物质，将原来的乳化剂从界面上顶替出来。常用顶替剂有戊醇，其表面活性很强，但碳链很短，不能形成保护膜,提高温度可使黏度下降，使乳浊液稳定性降低,离子型乳化剂所形成的乳浊液的稳定性，是因其分散相带有电荷；加入电解质，可中和其电性，促使聚沉；常用NaCl、NaOH、HCl、Al 3+等,CaCO3可被水浸润，但不能被有机溶剂润湿；将乳浊液通过CaCO3层时，乳浊液中的水分则被吸附。,如果在O/W型乳浊液中加入亲脂性的乳化剂，则乳浊液有从O/W转变为W/O型的趋向；但因在转变过程中，其他条件还不允许形成W/O型乳浊液，而使乳浊液遭到破坏。去乳化剂,二、浸 取,用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为浸取，也叫做浸出。固体浸取原理及流程浸取速率浸取过程的应用与设备,1、固体浸取原理及流程,载体的物理性质对于决定是否要进行预处理是非常重要的。浸取的流程示意图,双螺旋输送浸取器,中药材水提醇法,2、浸取速率,溶剂从固体颗粒中浸取可溶性物质过程包括以下步骤：溶剂从溶剂珠体传递到固体颗粒的表面；溶剂扩散渗入固体内部和内部微孔孔隙内；溶质溶解进入溶剂；通过固体微孔孔隙通道中的溶液扩散至固体表面并进一步进入溶剂主体；以上步骤都会影响浸取速率，所以受影响的因素包括分子扩散中的诸多因素。,3、浸取过程的应用与设备,三、超临界流体萃取技术,超临界流体萃取技术SFE是一种新型的萃取分离技术。超临界流体(SCF)是指在临界温度（Tc）和临界压力(Pv)以上的流体。高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。密度接近于液体，黏度和扩散系数则接近于气体，具有良好的溶解性和传递性，此特性在临界点附近受压力和温度影响更显著。超临界流体萃取的基本原理超临界流体萃取的技术优势超临界萃取装置与流程图超临界萃取实例,1、超临界流体萃取的基本原理,临界温度(Tc)：当气体的温度高于某一数值时，任何压缩都不能使它变为液体。临界压力（Pc）：在临界温度下，气体能被液化的最低压力。超临界状态：当物质所处的温度高于临界温度、压力大于临界压力时 一般来讲，超临界流体的密度越大，其溶解度就越大，反之亦然。也就是说，超临界流体中物质的溶解度在恒温下随压力P(PPc时)升高而增大，而在恒压下，其溶解度随温度（TTc时）增高而下降，这一特性有利于从物质中萃取某些易溶解的成分，而超临界流体的高流动性和扩散能力，则有助于所溶解的各成分之间的分离，并能加速溶解平衡，提高萃取效率。,部分超临界流体的临界性质数据,2、超临界流体萃取的技术优势,传质速度快选择性高适合提取热敏性物质节能显著“绿色”溶剂在微量成分的脱除方面有很大优势,3、超临界萃取装置与流程图,超临界萃取的方式,3、超临界萃取装置与流程图,几种典型的间歇式萃取系统（a）单级分离（b）两级分离（c）精馏+分离1.萃取釜 2.减压阀 3.分离釜 4.换热器 5.压缩机 6.分离釜 7.精馏柱,液相物料连续逆流萃取系统,4、超临界萃取实例,超临界CO2萃取柑橘香精油的设备流程示意图1.CO2储罐 2.高压泵 3.萃取釜 4，5，6.阀门 7，8，9.分离釜 10.回流阀,四、双水相萃取技术,双水相萃取技术也叫做水溶液双相分配技术。始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系。1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离。国内自20世纪80年代起也开展了双水相萃取技术研究。双水相萃取技术的原理和特点双水相的形成和类型影响双水相萃取的因素双水相系统的应用举例,1、双水相萃取技术的原理和特点,原理：目的物在不相溶的聚合物或无机盐溶液形成的两相中分配系数不同，从而进行分离。理论基础是表面自由能和表面电荷的影响。特点：优点是能够保留产物活性、可进行连续操作或分批操作、设备要求简单、萃取容易、操作稳定、极易放大、适合大规模应用。缺点是成本较高、纯化倍数较低、适合于粗分离。,2、双水相的形成和类型,形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。离子型高聚物和非离子型高聚物都可以形成双水相系统。常见的双水相系统：高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸盐或磷酸盐体系。,3、影响双水相萃取的因素,聚合物及其分子量的影响：不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性；pH 值的影响：改变两相的电位差；离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响：在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。温度的影响：分配系数对温度变化不是很敏感，只有处于临界点附近，才具有明显作用；,4、双水相系统的应用举例,例：分离和提纯各种蛋白质(酶）用PEG/-(NH4)2SO4 双水相体系,经一次萃取从-淀粉酶发酵液中分离提取-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。,1、定义 反胶束或称逆胶束(Reversed micelle)是指当有机溶剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会在有机溶剂中形成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”。,五、反胶团（胶束）萃取,2、影响反胶团萃取的因素（1）溶液的pH pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质（2）溶液的离子强度 影响微胶团的静电状态 凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。（3）表面活性剂的浓度和种类（4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）,3、应用举例 纯化和分离蛋白质 如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11.1 和6.8）,用二烷基磷酸盐/异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的pH 值调至9.0,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留在水相.,