原生质体培养与体细胞杂交.ppt
第九章 原生质体培养与体细胞杂交,原生质体的获得原生质体的培养体细胞杂交,原生质体的获得,原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离,原生质体的概念,指植物细胞除去细胞壁以外的部分,原生质体的用途,植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞的过程与机理等问题的良好实验体系。遗传转化：原生质体与外源DNA共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化。通过植株再生就可以得到转基因植物。,原生质体的用途,体细胞杂交由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合，进行细胞杂交。2个不同植物体细胞发生融合、形成新细胞的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。,原生质体的分离 机械法,高产量、高质量的分离原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。方法：机械法、酶解法机械法：通过对植物组织进行切割、研磨等方法破坏植物细胞壁，使原生质体游离出来的一种方法缺点:效率极低、原生质体破碎严重，完好的原生质体数量少优点：对原生质体以后的负面影响小,原生质体的分离 机械法,具体方法：Klercker（1982），大植物细胞置于高渗的蔗糖溶液中，使细胞质壁发生分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，在切割的过程中，有些细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体.适用范围：某些植物的贮藏组织，如：胡萝卜的根、洋葱的鳞片等细胞高度液泡化的组织.,原生质体的分离 酶解法,酶解法：1960年由英国的Cooking发明，是利用一些酶分解植物细胞壁而获得原生质体的一种方法。植物细胞壁组成：纤维素、半纤维素和果胶质优点：分离原生质体的效率很高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要方法酶制剂：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（离析酶）、崩溃酶（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶）,具体步骤：,材料的选择材料来源：细胞分裂旺盛的外植体，如幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或悬浮细胞.对于容易培养、再生那里较强的双子叶植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可用完全展开的叶片作材料.用于分离原生质体的植物材料要培养在最佳的光温条件下.,原生质体的分离 酶解法,酶解处理酶解处理对以后的原生质体培养至关重要.原则：利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间来获得大量有活力的原生质体.酶解液的准备：由于植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的，所以，酶解液中一般含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%,原生质体的分离 酶解法,渗透压的调节必要性：为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶解液中必须加入渗透压调节剂。常用的渗透压调节剂有：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为。具体用什么浓度，要根据材料的水势来确定。,原生质体的分离 酶解法,加入其它物质酶解液中加入较高浓度的Ca2+可以提高膜的稳定性；加入葡聚糖硫酸钾、KH2PO4也可以提高原生质体的稳定性和活力；加入牛血清蛋白可防止酶解过程对细胞膜和细胞器的破坏；在酶解液中加入pH缓冲剂有利于保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。,原生质体的分离 酶解法,原生质体的分离 酶解法,注意事项酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.,原生质体的分离 酶解法,酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞则要离心后再酶解。,原生质体的分离 酶解法,用量：材料与酶解液的比率为2-10g/100ml酶解液。温度和光照：一般在252、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。时间：酶解时间因材料而异，2小时-10几小时。,叶片的酶解法分离原生质体,原生质体的收集与纯化过滤：酶解结束后，要及时的将酶解物通过孔径为20-80m的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团。离心：滤液转到离心管中在50g下离心5min。反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留的酶液去掉。纯化：如原生质体不纯（如含有较多的细胞碎片），可用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。,原生质体的分离 酶解法,完整的原生质体,原生质体的分离 酶解法,原生质体活力的测定原生质体活力的高低对后来的原生质体培养和融合影响极大。测定原生质体活力的方法常用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。原生质体活力（%）=发荧光的原生质体数/原生质体总数100,原生质体的分离 酶解法,原生质体培养,发育过程：原生质体在培养过程中，首先形成细胞壁（原生质体由圆形变为一定形状），后来进行分裂、形成细胞团、愈伤组织、完整植株。,苜蓿,夜来香,1天,5天,7天,10天,4周,5周,7周,原生质体的培养方法,液体浅层培养将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。此种方法操作简单，对原生质体的损伤小，而且容易以后添加新鲜培养基和转移培养物。但原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间粘连，从而影响其进一步的生长、分裂；同时，原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。,原生质体的培养方法,固体培养（平板培养）30-35的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂糖凝固后，就成一薄层。平板培养时原生质体都被固定，容易观察、统计原生质体的分裂情况，但操作比较复杂。进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。平板培养在以后添加新鲜培养基和转移培养物方面也要复杂些。,原生质体的培养方法,液体固体结合培养液体浅层固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。,原生质体的培养方法,琼脂糖珠培养用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。这种方法改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。,看护培养,原生质体的生长、分裂,在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。,影响原生质体培养效果的因素,原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来衡量。植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。如Yamada曾用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有1个品种的原生质体再生了植株。一般来说，容易培养的植物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。,培养基,基本培养基不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为，原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。,培养基,有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强，所以培养基中大都要加2,4-D。条件化培养基：使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。,培养基,培养基中的渗透压：原生质体无细胞壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分裂和生长。,体细胞杂交,原生质体由于没有细胞壁的限制，所以2个原生质体可以彼此靠近，通过膜的融合而融为一体。如果2个相同的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍；如果2个原生质体不同，则就可以实现将2种不同植物的遗传物质组合在一起，形成一个新的杂种细胞，此杂种细胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。2个不同体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可以创造出新的植物个体。,
