第章基因工程.ppt

1,第十四章,基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,Xiu-feng GaoWest China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,2,一、自然界的基因转移和重组：接合作用，转化、转导作用，噬菌体DNA的整合,细菌的特异位点重组，转座重组，同源重组，插入序列的结构特点，转座子的结构特点。二、重组DNA技术 相关概念：克隆，基因工程,工具酶,目的基因,基因载体 基本原理和过程：目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,重组DNA的导入,重组体的筛选,克隆基因的表达。,主要内容,3,第一节 细菌的基因转移和重组Bacterial Gene Transfer and Recombination,.接合作用（conjugation）当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移到另一个细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用。,质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,一、细菌的基因转移,4,F factor:含有细菌性鞭毛蛋白的编码基因.,5,2 转化作用（transformation）,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,6,溶菌生长途径(lysis pathway)：噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA在宿主内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，溶解细菌，释放出新生噬菌体。,溶源菌生长途径(lysogenic pathway)：噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA整合进宿主染色上，随宿主复制而复制。,当遇到DNA损伤时，噬菌体（原噬菌体）从宿主菌（溶原菌）染色体上脱下来，进入溶菌生长途径。,转导作用（transduction）,7,3.转导作用（transduction）,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。,8,二、DNA重组(DNA recombination),同源重组(homologous recombination),特异位点重组(site-specific recombination),定义：不同DNA分子间发生的共价连接或DNA分子内较大片段的交换称为重组或重排。,转座重组(transposition recombination),自然界的基因转移和重组,9,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称为基本重组。是最基本的DNA重组方式:,以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制。,（一）同源重组,10,Holiday中间体,11,Holiday中间体,片段重组体,拼接重组体,C,12,同源重组关键步骤,同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口；两个单链对接，形成半交叉；半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA；形成Holliday中间体，Holliday中间体的变构和拆分。,片段重组体(patch recombinant)切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体(splice recombinant)切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,13,（二）位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,整合酶(intergrase,Int)：是噬菌体DNA编码的产物，是一种DNA结合蛋白，对噬菌体的的重组位点attP有强的结合力，催化attP和细菌重组位点attB之间的重组。,整合宿主因子(intergration host factor,IHF):细菌编码的产物。,切离酶(Xis):噬菌DNA编码的产物.,1.噬菌体DNA的整合,14,噬菌体DNA的整合,15,2.细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段倒位导致鞭毛相转变导致H1抗原和H2抗原的交替表达,16,H片段有两个特异重组位点（hix）为反向重复序列 H片段上有两个启动子P 其一驱动hin基因表达 H片段可在Hin和Fis控制下进行特异位点 重组(倒位)。另一正向时驱动H2和rH1基因表达 rH1为H1的阻遏蛋白基因。H片段反向(倒位)时H2和rH1不表达，H1表达。,H片段倒位导致鞭毛相转变要点,17,3.免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,RSS,RSS,RSS,18,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,19,V片段,J片段,RSS,RSS,间插DNA,OH,OH,分子内转酯反应,单链切开转移核苷酸修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,目 录,V片段,J片段,20,（三）转座重组(transposition recombination)定义：由插入序列(insertion sequences,IS）和转座子(transposons)介导的基因转移或重组。,（1）IS转座,IS转座发生形式：保守性转座：IS由原位到新位。复制性转座：IS复制后，复制本迁到新位到，另一个留在原位。,IS特征：IS两侧有二个分离的反向重复序列(inverted repeats,IR)一个转座酶（transposase)编码基因 IS插入靶位点的两侧产生正向重复序列（derect repeat,DR）,IR,Transposase Gene,IR,DR,DR,21,IS,靶位点,靶位点粘性末端切割,IS和靶位点共价连接,复制修复缺口形成DR,IS保守性转座,IR,IR,IR,IR,DR,DR,IS,22,插入序列的复制性转座,23,可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因,（2）转座子转座,24,25,第二节 重组DNA技术,重组DNA技术是对携带遗传信息分子进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。也就是人工操作基因的过程。,实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,26,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,27,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白）,DNA克隆(DNA cloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,28,（二）工具酶,29,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE),型酶 型酶,识别位点与切割位点不一致；没有固定的切割位点；不产生特异性片段；,型酶,识别位点是特异的；切割位点位于识别位点中或附近；产生特异性片段；是最常用的工具酶。,功能：能特异水解双链DNA的磷酸二酯键。,有特异切割位点；切割位点在识别位点以外；,30,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株或型；用罗马数字表示发现的先后次序。,Hind,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,限制性核酸内切酶命名,31,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE),定义：是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,作用特点：识别序列有特异性；大多数识别位点具有回文结构 酶解后产生特征性切口 平端切口 5末端突出粘性末端切口 3末端突出粘性末端切口,32,形成特征性切口,33,1.大多数酶是识别顺序不同，切割方式也不同。2.同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,34,3.同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,35,4.有些酶识别顺序相同，切割方式不同，产生不同的末端。,36,（三）目的基因,感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA（target DNA）或外源DNA.,1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),37,1.化学合成法,将要合成的DNA片段3端的第一个核苷酸固定在固相载体上；加入第二个核苷酸进行缩合反应；清洗；进行循环反应；每次只能合成80 个碱基，超过此范围的就要分段合成。,优点：合成速度快、准确性极高 适用：PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、小基因片段合成。,38,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,每个细菌都含一个重组DNA分子的多个拷贝,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。,2.从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,39,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,R cos右臂,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体感染大肠杆菌,cos L,R cos,目 录,cos L左臂,20 Kb 外源 DNA 片段,40,3.从cDNA文库获取目的基因,41,4.聚合酶链反应(PCR),94变性 5min,55退火,70引物延伸,第一个循环,25-30次循环后目的DNA可扩大100万倍,template DNA,42,（四）基因载体,43,1.质粒(plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,44,载体的选择标准,有自身复制子，在宿主细胞内能自主复制并能使目的DNA片段同步扩增；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有可供选择的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。考贝数要高表达载体要具备使目的基因表达的完整转录单位,45,是由一系列大肠杆菌质粒DNA经重组技术构建的克隆载体。1.有一个复制起点，能够独立复制；2.有很多单一酶切位点，可供目的基因插入；3.有选择标记，氨苄和四环素的抗性基因；4.分子量小，4363bp，可以转化进入宿主.,46,是由pBR322质粒与M13噬菌体的片段重组而成的dsDNA质粒，是最常见的克隆载体。a-互补：pUC质粒中的Lac Z基因编码b-半乳糖苷酶N-端的a片段，与宿主细胞编码的缺陷型b-半乳糖苷酶实现基因互补，合成完整的b-半乳糖苷酶.,47,pUC质粒内来源于大肠杆菌的Lac Z基因，此基因能编码b-半乳糖苷酶N-端的a片段，可与宿主细胞缩编码的缺陷型的b-半乳糖苷酶实现基因互补（a 互补）能分解5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷（X-gal），形成兰色菌落。当外源基因插入Lac Z基因时，宿主细胞不能合成完整的b-半乳糖苷酶，不能分解底物，为阳性菌落为白色，插入失败的为兰色（阴性）。这种筛选阳性重组子的方法称为蓝白斑筛选,蓝白斑筛选,48,2.噬菌体(phage),49,插入型载体：gt系列（适用cDNA克隆）置换型载体：EMBL系列（适用基因组克隆）,常用的噬菌体载体,l噬菌体DNA：是双链DNA分子；基因组48.6kb；呈线状排列；两端有单链互补末端；进入宿主后环化。,50,M13噬菌体：是环状单链DNA分子；只感染带有F-因子的细胞（JM101,JM103等）在宿主内通过不对称复制形成M13颗粒构建的M13噬菌体载体 M13mp系列pUC系列,51,粘性质粒(cosmid),有l噬菌体DNA的cos位点；有整个pBR322的DNA序列；可容纳35-45kb的外源DNA；可以体外包装成噬菌体；在宿主内复制同质粒。,常用的粘性质粒PJ88、PAC79、C2XB等,52,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,53,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.2-2Mb。,54,YAC 的主要功能成份,着丝粒：mitosis姊妹染色单体分离之必需。端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,55,二、重组DNA技术基本原理及操作,目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达,56,粘性末端连接方式(1)同一限制酶切位点或配伍末端连接,（三）外源基因与载体的连接,外源基因经DNA连接酶催化形成嵌合DNA的过程。,Bam H切割,T4 DNA连接酶,15C,+,目的基因用 Bam H切割,载体DNA用Bam H切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,(2)不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bgl 切割位点,EcoR+Bgl 双酶切,Eco R+Bgl 双酶切,T4 DNA连接酶,15C,重组体,GAATTCCTTAAG,AGATCTTCTAGA,GAATTCCTTAAG,AGATCTTCTAGA,AATTCG,GATCTA,GAATTCCTTAAG,AGATCTTCTAGA,ATCTAG,AATTCG,（3）人工接头连接,在平端载体或DNA片段加上新的酶切识别位点，酶切后可产生新的粘性末端。,（4）同聚物加尾连接,在末端转移酶的作用下，在DNA末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，效率较高。,(5)平端连接,限制性内切酶切割产生的平端;粘端补齐或切平形成的平端，效率较低。,61,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)：外源DNA（质粒导入细菌的过程。转染(transfection)：以噬菌体为载体构建的重组子导入细胞的过程。,（四）重组DNA导入受体菌,62,（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,66,显影或显色,将核酸固定到膜上,分子杂交法,菌落印迹原位杂交,斑点印迹杂交,Southern印迹杂交,Northern印迹杂交,将菌落或噬菌斑印迹到膜上,提取DNA或RNA,提取DNA,提取RNA,裂解细菌或噬菌体,变性DNA或RNA,琼脂糖凝胶电泳,变性DNA,将核酸点到膜上,将核酸转移到膜上,预杂交（消除非特异性吸附）,加入标记的探针杂交,菌落印迹原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,免疫学方法,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,71,重组DNA技术操作过程,小 结,72,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,转染,宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,目的基因（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,73,表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,74,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）原核表达载体的标准选择标志：便于重组子的筛选强启动子：能调控转录翻译调控序列：SD序列，翻译起始点多接头多克隆位点：定向插入外源DNAE.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体，很难表达大量可溶性蛋白,75,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程。,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞,76,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（一）基因诊断,三、重组技术与医学的关系,（二）基因治疗,基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,（三）重组DNA医药产品,78,1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,79,pET30b质粒图谱,80,pET30b多克隆位点,81,SDS-PAGE,M:Marker1:重组菌2：空质粒3：BL21,