微生物检测基础知识讲义.ppt

微生物检测基础知识,宗万里电子邮箱：,微生物检测基础知识,一、基本知识1.1什么是微生物?微生物是一群形体非常微小,肉眼看不到或很难看清它的生物,只有通过光学或电子显微镜,放大几百倍或几十万倍才能看清楚.,1.2微生物的分类 非细胞生物(病毒)微生物 原核生物(细菌)细胞生物 真核生物(酵母菌),1.3微生物的特点,1)个体微小（小于0.1mm，肉眼不可见）,结构简单.微生物多数是单细胞2)分布广（自然界中到处都有，如水、空气、土壤）等,种类多（10万多种）3)繁殖快数量大4)易于变异,适应能力强5)易于培养,代谢活力强,1.4腐败变质食品对人体健康的影响,产生厌恶感。由于微生物在生长繁殖过程中促使食品中蛋白质分解，蛋白质在分解过程中产生的有机胺、硫化氢、硫醇、吲哚、粪臭素等，具有蛋白质分解所特有的恶臭，使人嗅觉产生极其难受的厌恶感。另外细菌和霉菌在繁殖过程中能产生色素，使食品染上各种难看的颜色，并破坏了食品的营养成分，使食品失去原有的色香味，也使人产生不快的厌恶感。此外，油脂酸败的“哈喇”和碳水化合物分解后产生的特殊气味，也往往使人们难以接受。,降低食品营养。蛋白质腐败分解后产生低分子物质，因而丧失了蛋白质原有营养价值。脂肪酸败水解氧化营养成分分解，因而使营养价值严重降低。由于食品从生产加工到销售的整个过程中，有很多情况和因素均可促使食品腐败变质并具有毒性，而且可能使食品产生毒性的有毒物质多种多样，食品被污染的方式和程度也很复杂，因而腐败变质食品对人体健康造成的危害也表现不同。,一是引起急性中毒。在一般情况下，常引起急性中毒，轻者多以急性胃肠炎症状出现，如呕吐、恶心、腹痛、腹泻、发烧等，经过治疗可以恢复健康；但重者可出现呼吸、循环、神经等系统症状，抢救及时可转危为安；如贻误时机还可危及生命，有的急性中毒，虽经千方百计治疗，但仍给中毒者留下后遗症。,二是慢性中毒或潜在性危害。有些变质食品中的有毒物质含量少，或者由于本身毒性作用的特点，并不引起急性中毒，但长期食用，往往可造成慢性中毒，甚至可以表现有致癌、致畸、致突变的作用。食用腐败变质、霉变食物除了可以引起急性中毒外，还具有极其严重的潜在危害,1.5食品被微生物污染后对人体的危害,自然界有许多微生物存在，其中有少数微生物对人类、动物或植物有病害作用，这类微生物就称为病原微生物，也可称它为致病微生物，或简称致病菌。在自然界中除了少数能引起人体病害的病原微生物存在外，还有大量的、种类繁多的、非致病的腐生微生物存在，其中一部分微生物在一定的条件下，可以引起食品变质。,引起人类病害的微生物有多种，其中一部分是因侵入消化道而引起疾病的，与食品卫生有关的致病菌基本上就是这一类的病菌。在引起食品变质的微生物中，有些还能产生对人体有毒害的物质，当人体误食含有大量腐生微生物的食品或含有微生物毒素的食品后，就会发生不同程度的中毒。能在食品中产生毒素的微生物，多见于细菌和霉菌。,食品被微生物污染后对人体的危害可分为三种：细菌性食物中毒（常见的食物中毒）、真菌性食物中毒、消化道传染病。各种致病菌引起人类症状如下：沙门氏菌：主要有伤寒，食物中毒和败血症等等。（急性胃肠炎症状）金黄色葡萄球菌：侵入人体伤口会产生化脓性感染，恶心、多次呕吐、腹痛。致病性大肠杆菌：腹泻,消化道传染病是传染病中的一大类疾病，是由于食用了被微生物或寄生虫污染了的食品而发生的传染性疾病。这种传染病的病原菌具有很强的致病力，仅少量病原菌即可引起疾病的发生，并且人与人之间可以直接传染。细菌性痢疾、伤寒及副伤寒、霍乱等。,1.6食品微生物检测,食品微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究食品中微生物的种类数量、生理特性、活动规律及其对人和动物健康的影响。,1菌落总数的检测意义 食品可能被多种类群的微生物所污染，并在其中进行繁殖，食品中含有微生物数量的多少，可反映出食品被污染的程度如何，食品中细菌数越多说明食品的污染愈严重，愈不新鲜，细菌数少，说明卫生质量好。,菌落总数(依据方法GB/T4789.2-2003食品卫生微生物学检验 菌落总数测定)：食品检样经过处理，在一定条件下培养后(培养基成分、培养温度和时间、Ph、需氧性质等)，所得1ml(g)待测样品中所含菌落的总数。(GB/T4789.2-2003)单位cfu/ml(g)所的结果只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。目的是为了判定食品被污染的程度。,2大肠菌群的检测意义 在评价食品的卫生质量，也采用大肠菌群作为粪便污染的指标细菌，以含大肠菌群的多少作为依据。如大肠菌群数越多，表示受粪便污染的程度越大，受肠道中病原菌污染的可能性越大。,1.7食品微生物的检测项目,大肠菌群(依据方法:GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定)大肠菌群:一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。依据方法:GB/T4789.3-2003 食品中大肠菌群数以100g(ml)检样内大肠菌群最大可能数表示,3霉菌的检测意义霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。,霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。,因此,霉菌和酵母菌也作为评价卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来判定食品被污染的程度.,1.8玻璃器皿的洗涤,1)新玻璃器皿含有游离碱，应用2%盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水冲洗干净，如果被油性杂质污染可浸泡与重铬酸钾洗液中，再用水冲洗。2）对于盛有琼脂的平板，先把平板中的 琼脂刮去，如果培养基已经干涸，可放在肥皂水中煮沸，使琼脂融化后倒出，然后用清水洗涤。并用毛刷或海绵擦洗内壁，以除去粘在壁上的污垢。,3）沾有油脂的载玻片，先用皱纹纸擦拭，然后放入肥皂水中煮十分钟或在酒精碱溶液中浸泡30分钟再用自来水冲洗，洗后的载玻片再在稀的重铬酸钾洗液内浸泡两小时，取出，用自来水冲洗到无色为止，最后用蒸馏水冲洗数次，烘干或浸于95%酒精中备用。,4)清洁液的配制：重铬酸钾：100克 水 1000毫升 浓硫酸 250毫升 先将重铬酸钾置于大烧杯或搪瓷锅内，加入水加热使之溶化。待冷却后，慢慢加入浓硫酸，并不断搅拌即成。此溶液腐蚀性极强，只能用于玻璃和瓷器类清洁消毒，可以多次使用。待颜色变绿时，才失去效力。,1.9灭菌与消毒,消毒：是指应用物理或化学方法杀死物体表面和内部的病原微生物，而对非病原微生物 及其芽孢并不严格要求全部杀死。用于消毒的化学物质，称为消毒剂。灭菌：是指杀死一切病原菌和非病原菌及其芽孢，使物体上无任何存活的微生物,消毒与灭菌的区别 消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体.灭菌是指杀灭一切微生物的营养体,芽孢和孢子.,干热灭菌法,灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品灭菌。干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。,湿热灭菌法:,在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。,a高压蒸汽灭菌使用高压蒸汽灭菌锅时，应先打开气门，排除灭菌器内的冷空气再关上气门使灭菌锅内的压力升高0.07MPa 1150.1MPa 121灭菌完毕后，切断电源，等压力降到零后，再打开排气阀，打开灭菌锅盖，取出物品。适用于高压蒸汽灭菌的有：各种培养基，溶液，玻璃器皿、金属器械、工作服、橡胶用品。,b流通蒸汽灭菌 利用流通蒸汽灭菌器或蒸笼进行灭菌的一种方法.每天蒸煮一次每次30分钟,连续三天,又称为间歇灭菌.主要用于实验室一些不耐高温的培养基及其它液体材料c巴氏消毒 主要用于葡萄酒,啤酒及牛奶的消毒.这种方法可以杀死食品中常见的病原菌,及其他微生物的繁殖体,而有不损失食品中的营养物质d煮沸消毒,将液体材料加热煮沸至近100,维持10-20分钟可以杀死所有的细菌繁殖体,但不可能杀死全部芽孢.此法多用于实验室小件器械的临时消毒.,影响灭菌的因素,a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。,b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。,1.10无菌操作原则,用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作。如外科手术需防止细菌进入伤口.在各种生物实验中,为了防止微生物的生长和繁殖影响实验的进行,也要在无菌的环境下进行.,无菌操作的要求是:1操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭2操作过程中是界面与外界隔离,避免微生物的侵入,1)实验前，无菌室应打开紫外线灯灭菌30分钟以上,实验中应穿工作衣帽.2)严格无菌操作，接种针、接种环在使用前后都必须火焰灼烧。3)实验前后用75%（v/v）酒精对手消毒。4)沾有病原微生物的器材，应置于指定地点。废弃物应用5%苯酚浸泡。,1.11革兰氏染色,革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的.G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保留结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞膜上。呈紫色,G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。取 菌种培养物常规涂片,干燥,固定.2）草酸铵结晶紫染1分钟。,3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。,6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，10秒后水洗，吸去水分。7）滴加沙黄复染液复染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏阳性菌体都呈紫色，阴性菌体都呈红色,1.10显微镜的使用方法显微镜是检验工作中常用的贵重和精密仪器，对它的使用和保护必须十分重视。（1）姿势：使用显微镜时必须端坐，凳和桌高度适宜。显微镜应直立在桌上，不可将镜臂弯曲而使载物台倾斜，油液或菌液将流散而影响观察和污染。用显微镜观察标本时要两眼睁开（如开始不习惯，可以一手掩目，不可闭眼）,（2）光源：通常用日光灯或天然光线，不用直射日光，以免眼睛和镜头受损。若使用显微镜灯时，最好加以蓝色滤光片，以除去黄光的影响。光线的强弱可通过聚光器的升降、光圈的大小及反光镜的平面或凹面来调节，光线的适当运用是项重要的基本功。,3）检查：低倍镜：一般先用低倍镜开始观察标本，先从侧面注视镜头，用粗调节将物镜下旋到底或降到将接触标本时，再用左眼注视目镜中，旋转粗调节器，至视野中出现物象时，最后用细调节器使形象清晰。高倍境：低倍镜调节清晰后，换上高倍境，稍加调节，即可进行观察，要避免细菌悬液等污染镜头。,油镜：检查细菌常用油镜。使用油镜时要升高聚光镜，放大光圈，调节反光镜，使射入镜筒之光线最强。于载玻片上滴加镜油（香柏油）一滴，使接物镜下降和镜油接触（将触及载玻片）。注视目镜，转动粗调节器，使物镜上升少许，见到标本后，左手转动细调节器，使物象清晰；右手掌握移动器，检查标本。用油镜观察标本时，切勿用粗调节器下目镜，以免压碎标本片，损坏油镜头。油镜使用完毕，须用擦镜纸将镜头拭净。,加镜油的原理：主要是避免部分光线折射的损失。因油镜的折射率和玻片的折射率相近，而与空气的折射率相差较多，所以使用镜油的目的是将镜头的镜面和玻片之间的空间为镜油所充满，这样绝大部分光线可进入镜面内，使视野明亮，便于观察。,4)显微镜的保养：（1）移动显微镜时，一般右手握住镜臂，左手托住镜座，不可倒立，以免损坏。（2）显微镜要保持清洁，镜头上如有油污时，须用擦镜纸蘸取少许二甲苯轻轻擦拭，然后将二甲苯擦净，以免脱胶。如被细菌或粪便沾污时，应立即用纱布拭净。酸、碱、氯仿、乙醚及乙醇能使油漆脱落，损坏机件，应避免接触。,（3）显微镜使用完毕后，可将镜头转成八字形，将聚光器及镜筒下降至最低位置，用绸布包好，放入镜箱内。（4）显微镜时很贵重和精密的仪器，使用时要十分爱惜，各部件不要拆卸。（5）显微镜应放在干燥、清洁的室内，避免受潮发霉。,一般计算显微镜的放大倍数是：目镜的放大率物镜的放大率显微镜的放大倍数。例如，目镜的放大率为10，物镜的放大率为45，这时显微镜的放大倍数为450。,二、食品中微生物的检测。2.1实验前的准备工作1)营养琼脂的配置和灭菌，按照使用说明进行配制，12115分钟。2)生理盐水0.9%氯化钠溶液3)刻度吸管的灭菌(1ml、10ml、25ml)尾部塞(或不塞)棉花,用旧报纸包好,或者不包全部放入灭菌桶中.12115分钟高压蒸汽灭菌,4)9ml的盐水试管(18mm180mm)塞上橡胶塞后，121灭菌15min5)单料乳糖胆盐发酵管 按照乳糖胆盐的使用说明，配制成相应的溶液，分装到加有小倒管的试管(18mm180mm)中，加入量以没过小倒管为宜。塞上橡胶塞后，115 灭菌15分钟。,6)双料乳糖胆盐发酵管 只是称取乳糖胆盐的量加倍，其它与单料乳糖胆盐发酵管相同7)灭菌平皿 把多个平皿用报纸包好，或加入灭菌桶中，121灭菌15min8)伊红美蓝琼脂平板 按照伊红美蓝琼脂的使用说明配制成相应的溶液,在高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌,11515min.然后取出,在液体状态时(无菌操作)倒入平板中,每个平板约15ml,冷却凝固,待用,9）225ml灭菌生理盐水（12115分钟）10）高盐察氏培养基（按使用说明进行 配制和灭菌）,2.2实验操作1)在酒精灯火焰周围称取25g或吸取25ml样品加入到加有225ml生理盐水并经过灭菌的三角瓶中，充分振荡摇匀，制成(1:10)样品稀释液。2)用一支10ml的灭菌吸管,每次吸取10ml（1:10）样品稀释液，加入到1支双料乳糖胆盐发酵管中，重复做三支。,3）用一支1ml灭菌吸管，每次吸取1ml(1:10)样品稀释液，加入到3支不同的单料乳糖胆盐发酵管中。每次吸取1ml(1:10)样品稀释液，加入到2个不同的平皿中。吸取1ml(1:10)样品稀释液加入到一直9ml生理盐水试管中，充分振荡做成(1:100)样品稀释液,4)另用一支1ml灭菌吸管，每次吸取1ml(1:100)样品稀释液，加入到3支不同的单料乳糖胆盐发酵管中。每次吸取1ml(1:100)样品稀释液，加入到2个不同的平皿中吸取1ml(1:100)样品稀释液加入到一直9ml生理盐水试管中，充分振荡做成(1:1000)样品稀释液,5)另用一支1ml灭菌吸管,每次吸取1ml(1:1000)样品稀释液，加入到2个不同的平皿中6)把灭过菌的营养琼脂加热融化，冷却到46后，倒入加过样品稀释液的平板中，每次15ml左右。7）平板在36的培养箱中培养48小时观察结果。乳糖胆盐发酵管在36的培养箱中培养24小时观察结果。,8)菌落总数结果的记录及报告 平板培养48小时之后,取出记录每个稀释度的两个平板的菌落数.计数时可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏.求出同稀释度的两个平板平均菌落总数.一个稀释度使用两个平板应采用两个平板的平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片装菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而余下的一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2代表全平板菌落数.平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限),仅有一,条链,可视为一个菌落,如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计.选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以稀释倍数报告之.如果有两个稀释度的菌落数都在30-300之间时,若两者的比值小于或等于2,应报告其平均数,若大于二则报告其中较小的数字,如果所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数报告.如果所有稀释度的平均菌落数都小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以倍数报告之.如果所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之.,如果所有稀释度的平均菌落数都不在30-300之间,其中一部分大于300,一部分小于30,则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之,菌落数在100以内时,按其实有数报告大于100时采用两位有效数字,在有效数字后面的数值,以“四舍五入”法计算.为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示,9)乳糖胆盐发酵管在培养箱中36培养 24小时之后取出观察培养情况.如果没有变化,即为阴性管.如果乳糖胆盐发酵管中溶液的颜色由紫变黄,小倒管中有气泡生成.则应将产气的发酵管转种在伊红美蓝琼脂平板上,置于36培养箱内培养24小时.然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验.,在上述平板上,挑取可疑(蓝黑色)大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,放在36培养箱内培养24小时,观察产气情况,凡乳糖管产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.根据证实为大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数.,10)霉菌酵母计数(依据方法GB/T5009.15-2003食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数),以无菌操作称取检样25g(mL)，放入含225mL灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。用灭菌吸管吸取1：10稀释液10mL，注人灭菌试管中，另用1mI，灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。取1mLl：10稀释液注人含有9mL灭菌水的试管中。另换一支1mL灭菌吸管吹吸五次，此液为1：100稀释液。,按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mI，灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择三个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。然后将晾至45左右的培养基注入平皿中，并转动平皿使之与样液混匀，待琼脂凝固后，倒置于2528温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。,计算方法：通常选择菌落数在10150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母数。稀释度选择及菌落报告方式可参考GBT4789.2。报告：每克(或毫升)食品所含霉菌和酵母数以cfug(mL)表示。,