sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 实验目的和要求.ppt

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量,实验目的和要求 学习并掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。,实验原理,1.在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。,实验原理,2.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,实验原理,3.当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：10Mr=bmR+K 式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b 和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,实验步骤,1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。,实验步骤,2.配液：按照下表所列的试剂用量配制合适的凝胶,实验步骤,3.凝胶液的灌注和聚合：用移液管将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加满蒸馏水。一小时后，待分离胶凝固，倒出蒸馏水，用滤纸吸干，加浓缩胶，将梳子插入胶液顶部。,实验步骤,4.加样：用微量注射器依次在各个样品槽加样，加样量如下N5l P20lJ5lX5l标准蛋白质全部加入,实验步骤,5.电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电流控制在12A，样品进胶后，缓慢升高电流至4050A。保持电流强度不变。待指示剂染料靠迁移至下沿11.5cm处停止电泳，需23h。,实验步骤,6.剥胶和固定：电泳结束后，取下凝胶膜，卸下凝胶膜上的橡胶框，用镊子将短玻璃撬开后取出凝胶板。放入溴酚蓝固定液中，固定2h以上或过夜。,实验步骤,7.染色：弃去固定液，加入染色液。染色4h以上或过夜。8.脱色：染色完毕，倾出染色液，换23次脱色液，脱色一昼夜。9.观察测量：用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离,实验结果,1.相对迁移率mR=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）,实验结果,2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。,