发酵工程制药(FermentationEngineering)PPT.ppt

发酵工程（Fermentation Engineering）,第一节 概 述,发酵的相关概念 发酵工程的发展简史 发酵类型微生物发酵生产的药物,一、发酵的相关概念,发酵：传统发酵 生化和生理学意义的发酵 工业上的发酵,传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,工业上的发酵：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程 包括：厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等；通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,发酵工程：利用微生物的特定性状，通过现代工程技术在生物反应器中生产有用物质的一种技术体系。,二、发酵工程的发展简史,19世纪或更早:酿酒、酒变质20世纪初：一战-丙酮丁醇的发酵1929年1942：青霉素的发现及生产20 世纪40 年代：抗生素工业 20 世纪50 年代：氨基酸发酵工业 20世纪60年代：酶制剂工业70年代：非碳水化合物代替碳水化合物的发酵 80 年代以来：重组DNA 技术,第一个 大规模工业生产的发酵过程,厌氧发酵 有氧发酵,三、发酵类型及微生物发酵生产的药物,微生物菌体发酵 微生物的酶 微生物代谢产物发酵 微生物转化发酵 微生物特殊机能的利用,1、微生物菌体发酵,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,2、微生物的酶,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶 和胞外酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,3、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。,4、微生物转化发酵,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,微生物发酵生产的药物：,主要包括：抗生素类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类、甾体类激素、治疗酶及酶抑制剂,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。,发酵的流程：,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,菌种选育,第二节 发酵过程中的微生物,微生物：指形体微小(小于0.1mm)，结构简单，在适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显微镜才能看清楚的生物。目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：原核生物界：例如细菌、放线菌、蓝藻真菌界：例如酵母菌、霉菌、大型真菌原生生物界：例如草履虫、变形虫、衣藻病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、噬菌体,一、常见的药用微生物,1、细菌,细菌的形态：球形、杆形、螺旋形,细菌的繁殖：,细菌主要是以二分裂的方式进行的无性繁殖,细菌的结构：,特殊的结构：荚膜、鞭毛、芽孢,荚膜 主要成分为多糖，与其致病性有关。芽孢 细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆 性很强的休眠体,以度过不良的环境。,一般说，芽孢不起繁殖作用，只起度过不良环境的作用，芽孢对热、紫外线和许多有毒化学物质有很强的抗性,细菌的代谢类型：,自养：硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。异养：大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。腐生依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它可以引起食物的腐败。寄生从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根 瘤菌等。厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，产甲烷杆菌，乳酸菌等。,细菌的代谢类型与在生态系统中处于的地位?,异养需氧型异养厌氧型自养需氧型自养厌氧型,分解者或消费者,生产者,细菌的菌落：,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。,特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。,2、放线菌,介于细菌和真菌之间的一类微生物,放线菌的形态：,放线菌的结构,培养基,放线菌的分布 放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。放线菌的繁殖 放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。,常见放线菌：,连霉菌属 链霉素、金霉素、四环素诺卡氏菌属 利福霉素小单孢菌属 庆大霉素游动放线菌属 创新霉素,产生抗生素最多的一类微生物,3、真菌,伞菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，以寄生或腐生方式存在。,代谢产物：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱直接入药：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝等,常见真菌：,藻状菌纲：根霉-生产甾体激素、延胡索素及酶制剂子囊菌纲：酵母菌属担子菌纲：灵芝半知菌纲:曲霉属、青霉属、头孢菌属,4、病毒,化学组成形态单位功能排列方式,由蛋白质构成,衣壳粒,通常由1-6个多肽分子组成,保护核酸决定抗原特异性,使病毒呈现不同的形态,衣壳,病毒的繁殖,吸附,二、生产菌种的选育,自然选育自然突变与定向培养诱变育种杂交育种原生质体融合基因重组,自然选育,以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,采集对象：,从自然界分离的菌种,菌种保存：,斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法曲法保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法,第三节 发酵设备与消毒灭菌,发酵设备：种子罐、发酵罐发酵罐：生物反应器需氧微生物反应器（通气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）,尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保持清洁。所有阀门和接管处必须用蒸汽灭菌。容器主体的结构要简单、容易清洗。当反应器受到的外压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流入器内。大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培养基中的，统称为深层发酵罐的形式。,主要内容,（一）培养基及灭菌培养基的定义、成份培养基的类型培养条件培养基确定方法培养基的灭菌：空消、实消、连消（二）发酵工程制药的过程与控制种子的扩大培养定义、目的优良的种子应具备条件几个与种子有关的参数：发酵级数、种龄、接种量微生物发酵方式（三）思考题练习,一、培养基及灭菌,（一）、培养基的定义、成份,培养基（culture medium）：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,主要成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体、水,1、碳源,作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃工业上常用的糖类：葡萄糖、蜜糖,2、氮类,作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,（1）无机氮源：,常用：硫酸铵、硝酸钠特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：,(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,（2）有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸硫、磷、微量元素等,工业常用,实验室常用,3、无机盐的微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,4、使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟,4、生长因子、前体和产物促进剂,（1）生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或 合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少了合成生长素过程中的某种酶)，统称为营养缺陷型。,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,（2）前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组份 P107,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%,用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率,（3）产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,（5）水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,（二）培养基的类型,液体,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,基础培养基鉴别培养基选择培养基：在培养基内加入某种化学物质或去除某些营养物质以抑制杂菌。加富培养基：在培养基中加入特定的营养物质，以供少数特殊需要的微生物生长的培养基。富集培养：在培养基中加入特别的营养要素以增殖少数微生物的培养方式。,发酵培养基的要求：培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。,合成培养基:原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产 天然培养基：采用天然原料 原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产；原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,培养大肠杆菌常用两种培养基：M培养基(1L)：Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10,pH 7.0 YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl 10g，PH 7.2,固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,（三）培养条件,温度 pH值 氧种龄接种量,1、温度,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。,2、pH值,培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。微生物通过其活动也能改变环境的pH值。发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染 一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。通风和搅拌-搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。,3、氧,4、种龄与接种量,种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2.节约了发酵培养的动力消耗，3.并有利于减少染菌机会,一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。,（四）培养基确定方法,（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。,（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况。,（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。（6）根据生产和科学研究的需要选择培养基(7)根据经济效益选择培并基原料,（五）培养基的灭菌,主要湿热灭菌,空罐灭菌（空消）实罐灭菌（实消）连续灭菌（连消）,二、发酵工程制药的过程与控制,一、菌种的扩大与培养,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,无杂菌污染,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,几个与种子有关的参数：发酵级数种龄接种量,种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,1、斜面(AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%，,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,2.一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,3.二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列时结束，活力旺盛,二、青霉素生产的种子制备,制备过程,安培管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,1、斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天,注意湿度50%左右,2、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4、二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,发酵方式：,（1）分批发酵法(间歇发酵法)：先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。此法不易染菌，但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。,（2）连续培养法,在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保证流入和流出速度的一致。连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。,（3）补料分批培养法(流加法)在分批培养时，不断地供给培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的方法，称为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。,思考题练习,培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是：什么是前体？什么是生长因子？生长因子的来源？什么是产物促进剂？产物促进剂举例？什么是种子的扩大培养？种子扩大培养的目的与要求？种子扩大培养的一般步骤？什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？什么是种龄？事宜种龄确定的依据？什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？,To be continue,发酵工程（三）,主要内容：,发酵过程的控制（1）中间分析项目（2）发酵过程的影响因素及分析（3）发酵终点的确定发酵控制与中间补料视频讲座,中间分析项目,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等,从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等,产物产量,在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。,pH值,反映微生物代谢基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况；菌体生长和产物合成都需最适pH值pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性,糖含量,微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力 菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,氨基氮和氨氮,氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,磷含量,微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。,6、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态 显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。,发酵过程的影响因素及控制,菌体浓度的影响和控制营养物质对发酵的影响和控制温度的影响控制pH值的影响控制溶氧的影响控制染菌的影响及控制CO2的影响及控制泡沫的影响及控制,菌体浓度的影响和控制：,C大：产物的产量大；但营养物质消耗快营养成分改变，有毒物质累计，摄氧，影响产物合成C低：产物含量低控制：基础培养基比例适当、中间补料,营养物质对发酵的影响和控制,C源N源P酸盐补料,总原则：即满足菌体生长又适合产物合成,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。,温度的影响控制,温度对生长的影响：,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于026生长，嗜温菌适应于1543生长，嗜热菌适应于3765生长，嗜高温菌适应于65以上生长,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,最适温度的选择：,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为300C。,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段280C，合成期260C后期再升温；黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否,pH值的影响控制,发酵过程pH变化的原因：,1、基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,2、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行,（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用,（4）pH影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,四环素,最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,pH的控制,1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8,2、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,3、通过补料调节pH,4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,染菌的影响及控制,发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量,发酵染菌对不同品种的影响,放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,发酵终点的确定,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,参数：,抗生素单位过滤速度氨基氮菌丝形态pH值发酵液外观及粘度等,发酵工程（四）,基因工程菌的发酵,何为基因工程菌？宿主系统有哪些？基因工程菌菌发酵培养的目的和生产特点基因工程菌生产的产品,基因工程菌：在生物体外对DNA分子进行重组，然后克隆到适合的宿主细胞进行增殖和表达，所得到的重组体菌株即为工程菌宿主细胞-载体系统：大肠杆菌、G+细菌、酵母、哺乳动物细胞,（一）基因工程菌及宿主系统,1、大肠杆菌,如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。,这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。,2、G+细菌,枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，,酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。,3、酵母菌,4、哺乳动物细胞,哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。,（二）利用基因工程菌生产的特点,基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。,三、基因不稳定性,生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失、结构不稳定性宿主细胞调节突变,当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失,指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变,改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。,（四）基因工程菌生产的产品,基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下：,产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。,发酵工程在制药工业上的应用,抗生素发酵生产AA发酵生产维生素发酵生产,The end,