基于纳米技术的肺癌早期检测研究.doc

精品项目名称：基于纳米技术的肺癌早期检测研究首席科学家：赵建龙 中国科学院上海微系统与信息技术研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院 上海市科委一、关键科学问题及研究内容1、拟解决的关键科学问题本项目围绕肺癌早期检测的重大需求，采用多学科交叉、综合的研究方法，重点解决纳米材料的定向偶联和有序组装机理、低丰度样品富集及微弱信号检测方法以及肺癌早期预警、筛查和检测的新模式等三个方面的关键科学问题： （1）纳米材料的定向偶联和有序组装机理为了获得性能良好的生物功能化探针，生物分子在微纳米界面上组装后应该保持原有的生物活性，具有很好的生物相容性，这就需要研究纳米结构与生物分子的定向偶联和有序组装机理。定向偶联机理问题：如何实现生物探针在微纳米界面上的定向分布，使生物分子的活性部位背对界面，使其与靶分子结合时空间位阻最小。有序组装机理问题：如何实现生物探针在微纳米界面上的均一分布，不重叠，不堆积，呈现为功能化生物分子单层，使探针发挥最佳的靶分子性能。（2）低丰度生物样本富集及微弱信号检测方法早期肺癌病人的肿瘤标志物浓度很低，由于检测灵敏度低而出现假阴性。另外，生物标本（如血清等）中含有大量内源性分子和代谢产物，通常这些物质浓度远高于肿瘤标志物的浓度，是主要的干扰因素，由于标本成份复杂产生干扰而出现假阳性。本项目将研究肺癌标志物与纳米材料的相互作用机理以及在微流控芯片中的运动特性，设计相应的功能纳米器件，分离标本中干扰组份，保留待测分子及其活性，建立微量肿瘤标志物的高效分离提取富集方法和体系，以达到肿瘤标志物的高灵敏度检测。（3）肺癌早期预警、筛查和检测的新模式针对没有适合中国人群的肺癌早期检测敏感性和特异性的问题，联合检测多个肺癌标志物，利用高灵敏、高通量纳米检测技术和生物信息学分析方法，建立肺癌早期检测判别模型，同时提高检测敏感度和特异性，建立与早期肺癌显著相关的血清蛋白和核酸标志物谱，并在高危人群中进行验证，建立适合我国肺癌高危人群患者肺癌预警、筛查和检测的新模式。2、主要研究内容围绕肺癌早期检测的重大需求，针对相关的三个关键科学问题展开研究，然后利用临床标本对基于纳米技术的肺癌早期检测新方法进行医学验证，与影像学、痰细胞学方法进行对照研究。本项目主要开展以下四个方面的研究：功能纳米材料的制备和表面修饰、纳米探针的设计和构筑、纳米生物器件的研制以及临床验证等研究。1.1 功能纳米材料的制备和表面修饰功能纳米材料的制备主要包括制备荧光量子点材料，用于构建多种肺癌标志物的同步检测的纳米器件；包括制备表面等离子体共振金纳米结构和硅纳米线材料，分别用于构建表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器，用于肺癌标志物的超高灵敏检测。（1）荧光量子点的制备和表面修饰利用微波辅助水相量子点制备技术，合成出荧光产率高、光稳定性强、粒径分布窄的多种结构II-VI族量子点。选用适宜的化学或生物材料修饰量子点，使修饰后的量子点既保持原有的光学特性又具有良好的生物相容性。研究量子点尺寸及表面组成对其物理化学性质特别是光学性质的影响。（2）表面等离子体共振金纳米结构的制备和表面修饰研究不同表面等离子体共振金纳米结构如金纳米壳、金纳米星等的制备方法。研究在SiO2胶体晶膜微球表面金的沉积机理以及金纳米壳层复合结构的制备方法。研究金纳米壳层结构厚度和表面裂纹以及金纳米星枝角等的控制方法，及其对局域表面等离子体共振光谱（LSPR）及表面增强拉曼光谱(SERS)信号的影响。 （3）硅纳米线的制备和表面修饰研究光、电、温等影响因素对纳米硅材料的腐蚀作用机理，提高纳米硅材料自停止腐蚀的精度，发展硅纳米线阵列制造的新机理和新方法；研究掩模、腐蚀、保护等关键工艺的相互制约关系，提高硅纳米线尺寸和表面粗糙度的控制精度，研究不同基团在硅纳米线表面的硅烷化修饰技术。1.2 用于肺癌早期检测的纳米探针的设计和构筑纳米探针的设计和构筑主要是为了获得有良好生物活性和生物相容性的生物功能化探针，主要包括生物分子在荧光量子点、表面等离子体共振金纳米结构以及硅纳米线表面的定向偶联和有序组装。（1）量子点与生物分子的偶联和有序组装研究量子点与具有特异选择或识别功能的生物分子的定向偶联和有序组装；重点发展针对肿瘤早期检测的具有超灵敏度和特异识别能力的“纳米材料-生物分子”纳米生物复合探针；研究这些纳米生物探针同待测分子之间的相互作用及其识别能力。研究量子点与待检测标志物有特异识别的酶、抗体、基因等生物分子的有序自组装（非简单的物理吸附和无序偶联），除利用分子间作用力、静电作用实现量子点与生物分子的自组装外，重点发展基于特定生物分子介导的生物分子有序组装方法，即通过表面功能基团或特定生物分子介导，实现生物分子在量子点表面的定向偶联或有序组装。研究有效控制量子点的标记数量和标记位置的方法，获得既具有高标记效率又保持高活性的“纳米材料生物分子”生物复合探针。研究量子点与不同生物分子的偶联方式，建立一套温和、有效的生物标记方法，在此基础上建立不同功能团的量子点与抗体、酶和DNA等多种生物分子的偶联方法及其纯化方法，并建立相应的规范的操作指南。（2）生物分子在表面等离子体共振金纳米结构上的可控组装制备满足生物传感需要的高质量聚苯乙烯有序多孔金纳米结构基底，研究实验条件对其LSPR和SERS性质的影响；研究在金纳米结构基底的多孔层表面均匀、高效地固定抗体及配基分子的方法，以提高固定效率和固定化抗体及配基分子的稳定性；利用LSPR位移检测抗原-抗体、配基-生物大分子等的结合过程及结合容量等，得到生物分子相互作用的标准曲线、结合常数及检测灵敏度等，研究非特异性吸附对分析的影响；利用基于SERS分子独特的振动能级和相应的拉曼指纹图谱检测分子信息，并比较两种检测方法的结果。（3）生物分子在硅基纳米界面上的可控组装选择生物识别探针分子（抗体、核酸等），研究其通过不同的自身携带基团或衍生的基团在硅基纳米界面上的定位组装条件；研究其在界面上的有序性、方向性和三维形态，探索各种不同性质的生物探针在特定环境中的识别行为和捕获行为；研究通过共组装技术和界面封闭技术减少探针分子与硅基纳米界面之间的非特异性结合，优化硅基纳米生物界面的后处理条件，提高其稳定性和耐受性；最终获取生物识别探针在一维纳米材料界面上实现可控组装的若干共性条件。1.3纳米生物器件的研制首先针对肺癌早期检测，选择适当的联合检测肺癌标志物；然后构建微流控芯片用于样品中肿瘤标志物的富集，同时消除基质效应；最后出检测灵敏度高、信噪比、重复性、稳定性和信号均一性等性能良好的纳米生物器件，主要包括基于量子点的纳米生物器件、表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器。（1） 肺癌标志物的选择根据前期研究结果，综合文献报道，针对肺癌选择癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白21-1片段(CYFRA 21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、组织多肽抗原(TPA)、细胞维生素A结合蛋白(RBP)，1-抗胰蛋白酶(1-AT)、血清铁蛋白（FERRI）以及核酸标志物miRNA（现在已在肺癌患者中检测到的）: let- 7、miR-29、miR-205 , miR-99 b、miR-203、miR-202、miR-102 和miR-2042prec 作为早期肺癌联合检测标志物。（2） 微流控分析芯片分离、富集系统的构建针对临床检验待测样品（血清标本）具有干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性。利用微流控芯片和纳米磁珠，研究实现微量肺癌标志物的有效纯化和富集的方法，主要研究纳米磁珠与肺癌标志物的相互作用，以及微流控技术对结合纳米磁珠的定向富集特性。设计微流控芯片的各个功能单元，包括样品采集、富集、反应和分离等，同时解决微流控芯片的稳定性和重复性问题，最后可以分离临床标本中干扰组份，保留待测分子及其活性。（3）基于量子点的多种肺癌标志物联合检测生物器件的构建为了达到多种肺癌标志物同时检测的目的，拟采用夹心式免疫分析方法同时检测多种肺癌标志物。将捕获探针与纳米磁珠结合，将信号探针与荧光量子结合，固定有捕获探针的纳米磁珠和固定有信号探针的量子点与待测样品中肺癌标志物夹心结合之后，利用微磁场实现纳米磁珠的定向分离和富集，然后通过检测量子点信号的颜色和强度来确定肺癌标志物的种类和丰度。光学检测系统基于超光谱成像原理构建，然后通过自主开发的检测分析软件解析出荧光量子点标记种类和待检测肿瘤标志物分子信号强度的对应关系，完成对检测结果的分析。（4）表面等离子体共振传感器选择典型的肺癌标志物作为典型的检测体系，研究生物分子等在金纳米结构基底多孔层中的固定以及抗原-抗体等生物分子相互作用，探索利用LSPR和SERS两种互补模式检测样品，在同一基底上实现LSPR与SERS分析技术的组合，建立基于该基底的生物纳米传感检测新方法，用于单个肺癌标志物生物分子的检测。（5）硅纳米线传感器选择多种肺癌标志物作为模式靶，研究组装高度有序的功能化硅纳米线捕获元件的方法，研究影响硅纳米线和生物组装效果的关键因素；研究传感器的可靠性和稳定性封装技术，完成基于硅纳米线的生物传感器组装，用于肺癌标志物（蛋白标志物或核酸标志物）的超高灵敏检测，可检测单个肺癌标志物分子。1.4 临床验证临床验证主要包括大样本的回顾性研究和前瞻性研究以及生物信息学分析。（1） 回顾性研究本项目拟开展的临床验证主要利用1500例以上肺癌病人（包括Ia-Ib期，肿瘤直径小于3cm）的血清、组织标本和癌旁标本以及健康对照血样，比较新技术与常规诊断方法对肿瘤标志物检测的吻合度，比较新技术的检出率与低剂量螺旋CT、常规血清肿瘤标志物、痰脱落细胞检测等方法对早期肺癌的检测敏感度和特异性。通过相关性分析，确定不同病理类型、不同分化程度和不同分期（TNM）的肺癌的特征性mRNA谱，通过ROC曲线分析确定几种标志物联合检测提高肺癌早期诊断的敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程的判别模型（确立“正常值范围”），同时利用肿瘤发生前后病人的自身对照血样进行模型修正和校验。（2） 前瞻性研究利用建立的判别模型，对3000例肿瘤高危人群进行筛查，分别采用新技术和常规诊断方法，如低剂量螺旋CT、痰细胞学和常规血清肿瘤标志物检测对受试人群进行检测，比较新技术与常规诊断方法之间的吻合度。对于新技术检测阳性的健康人随访24月，观察受试者的预后，比较检测结果与临床预后之间的相关性，以评价新技术用于肺癌早期检测的可行性。初步推测在3000个高危人群中待随访结束时可确诊肺癌50-60例。（3）建立在临床标本的生物信息学分析方法在大量样本的基础上，将肺癌关联标志物随机分群，利用生物信息学分析方法，找到哪些标志物群可以集中体现在某个标志物上，获得最优肺癌早期检测标志物组合，同时具有高敏感性和特异性。二、预期目标1、项目总体目标本项目面向肺癌早期检测的重大需求，研究纳米材料的制备和表面修饰、生物分子偶联、多种肺癌标志物的联合检测以及高灵敏度检测器件的构建，旨在相关基础科学研究上取得突破，获得源头创新。首先探明纳米材料或纳米结构与具有特异选择或识别功能的生物分子相互作用的机制，达到生物分子的定向偶联和有序组装，在此基础上，研制出用于多种肺癌标志物高灵敏联合检测的纳米量子点生物器件。同时，研制出基于金纳米结构的局域表面等离子共振和拉曼光谱传感器和硅纳米线传感器，作为量子点生物器件辅助方法，用于肺癌标志物的超高灵敏检测。通过大样本临床验证，探明肺癌标志物与肿瘤发病进程的关系，纳米生物器件的检测敏感性和特异性均高于85%，最终在肺癌高危人群的早期检测中得到示范应用，从而指导肺癌的早发现、早治疗，提高病人存活率，减小病人经济损失，为人民健康、国民经济建设、社会和谐发展作出贡献。同时培养一批高水平青年科技人才。2、五年预期目标（1）对解决国家重大需求的预期贡献国家中长期科学和技术发展规划纲要明确指出：疾病防治要“重心前移，坚持预防为主、促进健康和防治疾病结合。本项目的完成可以解决肺癌的早期检测关键技术，从而显著提高肺癌治疗的存活率，为人民健康和国民经济建设作贡献。同时通过纳米材料、生物、医学、信息等多学科交叉研究，进一步推动纳米材料在生物医学中的应用，增强我国在纳米科学领域的国际竞争力。（2）在理论、方法、技术等方面预期取得的进展、突破及其科学价值1）新模式：获得肺癌早期预警、筛查和检测的新模式，包括肺癌标志物种类、丰度和肺癌发生的判别新模型，肺癌标志物异常与肺癌发病进程的关系，多种肺癌标志物与肺癌分型、发生、发展及愈后程度的相关性。2）新方法： 肺癌标志物富集和基质效应消除方法利用生物大分子与纳米磁珠的相互作用，以及微流控技术对纳米磁珠的定向富集，建立肺癌标志物分离纯化方法，同时减小干扰成分的影响，最终实现肺癌标志物的有效富集。 肺癌标志物的快速、联合检测方法采用夹心式免疫分析原理，固定有捕获探针的纳米磁珠和固定有信号探针的量子点与待测样品中标志物夹心结合之后，利用量子点信号的颜色和强度来确定标志物种类和丰度，检测反应在液相中进行，具有更高的检测速度。3）新技术（成果形式）： 多种肺癌标志物联合检测技术：对早期肺癌检测的敏感性和特异性均高于85%，对抗体的检测限达到皮克/毫升 (pg/mL)水平，对核酸的检测限达到单碱基差异和皮摩尔(pM)水平，实现4种以上肿瘤标志物的快速联合检测； 基于表面等离子体共振金纳米结构的传感器：灵敏度达到单分子水平； 硅纳米线传感器：灵敏度达到单分子水平； 用于肺癌高危人群筛查的试剂盒：完成高灵敏度试剂盒的小批量生产，并完成1500例临床标本测试和医学验证，完成产品注册申报的准备工作。（3）优秀人才培养培养高水平学术人才：形成一支思维活跃、创新能力强的基础研究团队，造就具有国际影响力的领军人物1-2名；培养博士、硕士150人；五年内发表SCI、EI收录学术论文200篇以上，领域内顶级期刊上发表文章20篇，出版1本以上专著，申请发明专利50项。三、研究方案1、总体研究思路面向肺癌早期检测的重大需求：本项目以肺癌早期检测为最终目标，目前的临床诊断主要以影像学和痰细胞学为主，无法做到真正的早期检测，而血清学检测又缺乏单一敏感和特异的肺癌标志物，因此，本项目将以多种肺癌标志物的敏感和特异联合检测作为实现目标手段。需要解决三个方面的科学问题：纳米材料的定向偶联和有序组装机理、低丰度样品富集及微弱信号检测方法以及肺癌早期预警、筛查和检测的新模式。通过学科交叉，实现技术突破：在荧光量子点、微流控芯片、表面等离子体共振传感器、硅纳米线传感器和肺癌临床治疗的方面，我国已有较好的研究基础，但相互的结合比较少，创新能力未得到充分发挥。本项目将研究三种高灵敏检测技术，（1）荧光量子点与微流控芯片技术相结合，研制纳米生物器件，用于多种肺癌标志物的敏感和特异同步检测；（2）研制基于金纳米壳的拉曼光谱传感器，用于肺癌标志物的超高灵敏检测；（3）研制硅纳米线传感器，用于肺癌标志物的超高灵敏度检测。其中（2）和（3）作为（1）的技术补充。在此基础上，利用临床大样本进行医学验证，并用于肺癌高危人群的早期检测，获得肺癌标志物与肺癌发病进程的关系，得到肺癌早期预警、筛查和检测的新模式，以指导肺癌的临床治疗，促进人类健康水平的提高。（见图1所示）图1 项目的总体研究思路2、技术路线本项目通过学科交叉，充分结合各单位在荧光量子点、微流控芯片、表面等离子体共振传感器、硅纳米线传感器和肺癌临床治疗等方面的优势，实现技术突破。主要包括四方面内容，（1）肺癌标志物富集微流控芯片，用于血液样本中肺癌标志物的分离、纯化和富集；（2）基于荧光量子点的纳米生物器件，用于多种肺癌标志物的敏感和特异同步检测，通过量子点信号的颜色和强度确定肺癌标志物的种类和丰度；（3）基于表面等离子共振金纳米结构的传感器和硅纳米线传感器，用于超低丰度肺癌标志物的检测；（4）利用研制的纳米生物器件，对临床样本进行检测，并与常规方法对照，以验证技术可行性。具体技术途径分述如下：（1）肺癌标志物富集微流控芯片针对临床样品干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性，利用微流控芯片和纳米磁珠技术，实现微量肺癌标志物的有效纯化和富集，同时去除可能的背景杂质。根据检测对象的要求，设计微流控分析平台的各个功能单元，包括样品采集、富集、反应、分离检测等，通过模拟分析进行有效集成；选择石英玻璃或聚合物材料（PDMS、PMMA、SU-8等），基于MEMS加工工艺，制造微流控芯片；基于电驱动原理，优化电场、缓冲介质等条件，解决反应条件难于控制、进样量较少、进样重现性较差以及样品中不同组分富集率差异等问题，解决稳定性和重复性问题，最后用于临床样本中肺癌标志物的富集。芯片的具体结构如图2所示。图2 肺癌标志物富集微流控芯片（2）基于荧光量子点的多种肺癌标志物联合检测生物器件根据需求设计和制作不同尺寸和特性的荧光量子点，然后在纳米磁珠上偶联上捕获探针，在量子点上偶联上信号探针。将功能化的量子点探针和纳米磁珠探针加入待测样本中进行反应和检测。固定有捕获探针的纳米磁珠和固定有信号探针的量子点与待测样品中肺癌标志物夹心结合之后，利用微流控芯片对磁珠的定向富集，将未结合磁珠的量子点去除，采用光学检测系统采集量子点的荧光图像，通过荧光量子点信号的颜色和强度解析出肺癌标志物的种类和丰度，完成对检测结果的分析。 量子点的制备以廉价的CdCl2、Te、Na2S、ZnS等为原料，利用微波辅助水相量子点制备技术，通过优化半导体量子点的制备条件（反应温度、时间、pH等），实现量子点的可控生长和组装，精确控制量子点的生长尺寸和粒径分布，合成出荧光量子产率高、光稳定性强、粒径分布窄的多种结构II-VI族量子点如CdTe/CdS、CdSe/ZnS等。采用场发射透射电子显微镜、场发射扫描电镜、X-射线单晶衍射仪等表征量子点的微观结构；利用瞬态和稳态荧光光谱和紫外吸收光谱研究量子点的光物理行为和光化学稳定性。采用原位包覆、配体交换、静电自组装以及二氧化硅包覆等方法对量子点表面进行修饰或包裹，以减少量子点表面富余的离子基团，减低量子点探针的非特异吸附，改善量子点的水溶性，解决量子点的生物相容性问题；以人类白血病K562细胞为研究对象，考察不同浓度和不同培育时间下量子点对K562细胞的毒性实验，以评价量子点的生物相容性。 量子点与生物分子偶联和有序组装生物分子偶联和有序组装主要包括量子点与生物分子的自组装、复合探针的纯化以及性质鉴定和性能评价。纳米生物自组装：研究量子点与待检测标志物有特异识别的酶、抗体、基因等生物大分子的相互作用机理及其偶联或自组装方法。除利用分子间作用力、静电作用实现量子点与生物分子的自组装外，本项目重点发展基于特定生物分子介导的生物分子有序组装方法，即通过表面功能基团或特定生物分子介导，实现抗体和基因在量子点表面的定向偶联或有序组装。例如，未端标记Biotin的DNA先联接在量子点QD表面上，得到QD-DNA-biotin复合物，再与链霉亲和素（Strepavidin）自组装（基于biotin与avidin的特异性结合），可获得DNA分子介导的有序组装纳米复合探针QD-DNA-biotin-Strepavidin；或者免疫球蛋白G（IgG）通过EDC/NHS偶联方法与QD连接，再与特定的单抗（Ab）自组装，可获得IgG分子介导的探针QD-IgG-Ab。通过这些定向偶联或有序组装，可以有效解决纳米材料与生物分子间因简单的物理吸附或无序偶联而导致纳米生物复合探针稳定性差和生物识别功能失效的问题，从而实现构建高效的纳米生物复合探针。制备与纯化：将荧光量子点与生物分子通过各种浓度配比、缓冲体系、温度、时间进行自组装反应，产物通过色谱技术或超滤技术等进行纯化，去除游离量子点和生物分子，纯化探针贮存于含有多种保护组分的储存缓冲液中，备用。性质鉴定：应用原子力显微镜和荧光光谱仪等鉴定纳米生物复合探针的物化性质，如尺寸大小、量子效率、分散性等；应用免疫沉淀反应鉴定探针的靶蛋白结合性能；通过发光效率与生物活性的时间曲线鉴定探针的稳定性。 纳米生物器件的研制选择相对较低廉的PDMS材料基于聚合物微加工制备微流控芯片平台，该芯片包括待测样品采集、富集、混合、反应、分离和检测等功能模块；基于磁珠分离和富集技术实现肿瘤标志物的高效富集。设计和制作微混合器实现反应组分有效混合，以及提供特定的温度条件提高反应效率等。基于超光谱成像检测原理，设计并制造光学检测装置，为提高检测装置的可靠性，整个装置拟采用模块化设计，包括光源和光学元件模块、信号采集处理模块、微流控芯片台模块、仪器自动控制、数据存储和显示处理模块，以及外壳等，达到美观、实用和集成的要求。另外，根据标志物临床检测要求，开发数据分析软件，实现检测谱图的显示和存储，各组分相对含量的计算、比对和统计，并最终以常规检验报告单的形式打印输出。纳米生物器件具体结构如图3所示。图3 基于荧光量子点的多种肺癌标志物联合检测生物器件（2）基于表面等离子体共振金纳米结构的传感器 表面等离子体共振金纳米材料的规模化制备和表面修饰利用自组装和胶体还原化学技术规模化制备出具有合理核-壳比的金纳米壳材料，使其产生的等离激元共振吸收峰的峰波长位置位于近红外光区并适合全血分析的要求；完善金纳米壳材料表面生物功能化途径；研究抗体等生物分子在金纳米壳材料表面的固定的方法；通过对金纳米壳材料的功能化修饰，将生物分子识别作用和金纳米壳材料的光学特性巧妙地结合在一起。对金纳米壳表面进行功能化修饰可以增加稳定性、生物相容性，排除非特异性干扰，可以使其更好地与生物体系结合，提高其生物分子识别能力。通过LSPR吸收峰位置变化定量分析全血体系中肺癌标志物；建立基于LSPR原理的肺癌早期诊断新方法。 用于肺癌早期检测的纳米探针的设计和构筑完善有序排列、厚度可控及大面积均匀的SiO2胶体晶膜的制备体系，制备满足各种需要的不同微球直径和厚度的氨基化SiO2胶体晶膜；以吸附的GNPs为核，选择不同还原剂，还原AuCl4-，控制反应速度和沉积时间，在SiO2胶体晶膜微球表面沉积金制备金纳米壳层复合结构。通过控制微球直径、金纳米壳层结构的厚度以及表面裂纹等调控LSPR，研究SERS对于LSPR吸收峰波长的依赖性；制备满足生物传感检测需要的高质量聚苯乙烯有序多孔金纳米结构基底并研究各种实验条件对其LSPR和SERS性质的影响，通过调节LSPR使SERS信号最优化；在聚苯乙烯有序多孔金纳米结构基底的多孔层表面均匀、高效地固定抗体及配基分子，提高固定效率和固定化抗体及配基分子的稳定性，研究靶标分子在不同孔径多孔层中的微流体性质；利用LSPR位移检测抗原-抗体、配基-生物大分子等的结合过程及结合容量等，得到生物分子相互作用的标准曲线、结合常数及检测灵敏度等，研究非特异性吸附对分析的影响；利用基于SERS分子独特的振动能级和相应的拉曼指纹图谱检测和鉴别分子信息，比较两种检测途径的分析结果，证明LSPR与SERS的互补性等。 基于等离子体共振金纳米结构传感器的研制通过控制SiO2胶体微球直径、胶体晶膜厚度、金纳米壳层的厚度以及表面裂纹等调节基底LSPR吸收峰波长位置使SERS信号最优化，实现稳定、可重复的有序金纳米壳结构SERS基底的规模化制造；在基底多孔层表面形成均匀及高稳定的吸附肺癌标志分子层，减小环境中的背景噪音，提取增强光学信号信号；最终研制出基于纳米金结构拉曼光谱传感器，用于肺癌标志物的高灵敏度定量分析。传感器结构如图4所示。 图4 基于金纳米结构的肺癌标志物拉曼光谱传感器示意图（3）硅纳米线传感器硅纳米线传感器主要利用探针分子和被分析物特异结合在硅纳米线表面，产生电场或者电势的变化，实现针对特定基团的生物检测。它的主要优点是超高灵敏度、直接电读出、无标记、易于与电路实现整体集成。该传感器主要包括硅纳米线制备、功能探针有序组装和传感器构建。 硅纳米线的制备基于硅材料的工艺选择性，采用IC工艺构建自对准的硅纳米线腐蚀掩模版，可以实现硅纳米线尺寸的精确可控和批量加工制造。本方法主要是通过工艺选择性来制造纳米线，与具体的工艺参数相关性非常小，完全可以在实现纳米线准确定位的同时，实现硅纳米线尺寸的精细控制。具体是：选用低掺杂SIMOX SOI圆片，通过氧化、光刻工艺，以氧化硅为掩膜，利用TMAH对硅进行腐蚀形成（111）面。再使用低温化学气相沉积（LPCVD）生长Si3N4，保护已腐蚀的出的硅（111）面。在距离该面不远的地方光刻开出窗口，腐蚀二氧化硅直到接近已形成的硅(111)面的上端。使用TMAH溶液腐蚀表层硅，形成横截面为等腰三角形的三棱柱。最后，淀积铝制作电极，完成硅纳米线的制作。 生物分子在硅纳米线表面的有序组装选择生物分子（以DNA探针为例），利用其本身携带或衍生的基团实现其与硅纳米线表面的偶联；设计DNA探针分子支架末端修饰方案，使修饰端与硅纳米线表面实现共价偶联。优化各项偶联条件，使该复合结构中的生物分子保持后续生物反应活性（探针的生物识别性能和生物分子的滚环复制性能）；同时减少探针分子与硅纳米线之间的非特异性结合，优化该纳米生物复合结构的后处理条件，提高其稳定性和耐受性。具体包括：将抗体加入磷酸纳缓冲液（含 PNGase F 酶）中进行酶解去糖基化。然后加入胃蛋白酶琼脂糖、Triton X-100，振荡反应，用醋酸纳缓冲液洗脱产物，超滤浓缩并转移至磷酸钠溶液中，得到纯的F(ab)2。上述溶液经2-巯基乙胺处理，然后经磷酸钠缓冲液透析过夜，然后过柱脱盐，除净巯基乙胺，得到的Fab；5端修饰功能基团（氨基或炔基等）；将官能团修饰的Fab（蛋白质探针）和DNA 寡核苷酸，通过化学键合实现定向偶联在特定的纳米界面区域内；首先在特定区域组装Fab，然后在其余区域装配DNA 寡核苷酸。组装完成后，加入纳米界面封闭液（含有酪蛋白、随机DNA序列、两亲有机分子等）对界面进行钝化。鉴定方法：免疫分析法鉴定Fab探针与靶分子的结合性能，计算亲和常数，统计活性变化情况；比色与电泳法结合鉴定DNA 的组装效率。 硅纳米线传感器的研制通过控制生物分子在硅基纳米线表面的有序性、方向性和三维形态，实现硅基纳米线表面的高可控生物组装制造。完成生物探针分子在硅基纳米线表面的密度调控组装后，通过测量硅纳米线传感器源漏电流值，并比较结合目标检测物前后的源漏电流值，就可以得到肺癌标志物的特异性响应。主要包括：采用硅烷化试剂APTES乙醇溶液和羧基活化剂实现硅纳米线表面硅烷化，然后进行miRNA探针组装，测量miRNA杂交缓冲液和参比的结果，得到对目标检测物的特异性响应。（4）临床医学验证研制出的纳米生物器件提供给医院进行临床试验应用和考核，利用大样本肿瘤病人（目前已有的肺癌血清和组织标本）和健康对照血样（大致相同的人数）和组织标本（肺癌患者手术的癌旁组织），检测样本的肿瘤标志物丰度，通过相关性分析，确定不同病理类型、不同分化程度的肺癌的特征性microRNA谱，通过ROC曲线分析，确定几种肺癌标志物联合检测提高肺癌早期诊断的敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程的判别模型。利用建立的判别模型，对肿瘤高危人群进行筛查、随访24个月，评价它们在肿瘤早期检测中的价值。具体的方案如图5所示。 图5 生物标记物（以核酸为例）判别模型的建立路线示意图根据相关临床标本选择标准选择肺癌标本、癌旁组织标本及肺癌患者和健康对照组（非吸烟者）的血清标本和痰标本，进行核酸提取和蛋白提取，利用研制纳米生物器件，针对以上的核酸和蛋白标本进行检测，与病理类型、细胞分化程度、分期（TNM分期）进行相关性分析，并通过ROC曲线分析确定几种标志物联合检测提高肺癌早期诊断的敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程的判别模型。利用该判别模型进行高危人群的筛查，高危人群的招募期限为1年，共招募3000人，入组标准： 吸烟指数在400以上、年龄大于40岁者; 有肺癌和其他恶性肿瘤家族史者; 有职业暴露史者（煤烟、油烟、放射线、石棉）。有慢性肺部疾病者（如肺结核、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病）。同时招募健康对照者（人数未定），其入组标准为：同高危人群性别、年龄匹对无吸烟和被动吸烟史、无肿瘤家族史、无慢性肺部疾病者。入组时检查项目：对招募的患者行外周血和低剂量螺旋CT（胸部检查），血样行蛋白标志物和微RNA检查。其他任何处理取决于就诊医生。在随访24月期间内患者分为分为以下几组（如有任何症状，检查和治疗取决于就诊医生），至患者确诊时，记录病理类型、分化程度、TNM分期、核酸和蛋白标志物浓度、其它任何不良事件（其它恶性肿瘤等），检查流程如图6所示。 图6 利用建立的判别模型进行肺癌高危人群筛查流程大临床标本生物信息学分析方法：根据大规模临床验证，利用贪婪算法搜索支持向量机分类器状态下，对样本分类的准确率最高的特点，将肺癌关联标志物随机分群，利用贪婪算法测试和评估训练样本集和预测样本集中，找到哪些标志物群可以集中体现在某个标志物上，哪些标志物群对特异性的肺癌类型有较高的特异性和敏感性，从而获得最优肺癌诊断标志物组合。在此基础上，获得肺癌早期预警、筛查和检测新模式，完成肺癌早期检测的应用流程制订，用于指导肺癌高危病人的筛查和检测。3、可行性分析本项目根据设定的研究目标和研究内容，凝聚了一支来自国内主要优势单位的多学科紧密配合的创新群体，中科院上海微系统与信息技术研究所、东南大学、南京邮电大学、复旦大学附属中山医院、天津医科大学附属肿瘤医院和香港城市大学深圳研究院等单位联合申请，各单位在各自的领域具有扎实的研究基础，符合优势互补，强强联合的要求。在项目预研过程中，各单位之间就已开展通力合作，形成了科研能力强的研究联合体，已经具备了开展本项目的软硬件条件。联合申请单位对项目的科学问题和研究内容进行了长期的调研、分析和讨论。除了注重科学前沿性之外，密切关注国外最新发展动态，确保项目的学术思路正确、技术途径可行。各单位在国家自然科学基金、国家863计划等的资助下，已经开展了肺癌早期检测相关的肿瘤标志物、荧光量子点、探针标记、微流控技术、表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器等相关的基础研究，并取得了一些创新成果，为本项目打下了扎实的基础。与本项目相关的主要研究成果如下：（1）在肺癌早期检测的临床研究方面在肺癌早期诊断方面曾先后承担国家自然基金和卫生部肺癌早期诊断课题，用改良的二步PCR方法检测痰脱落细胞中K-ras基因的突变，提高敏感性约20。研究发现非小细胞肺癌hTERT表达阳性率为86.3%，与c-myc mRNA表达存在显著相关，能辅助诊断肺癌、判断肺癌预后。与上海市肿瘤研究所的合作研究检测肺癌基因甲基化的发生和转录水平的变化，发现人非小细胞肺癌细胞株WT1、RASSF1A、MYDO1、GMGT、RAR基因启动子CpG岛发生甲基化与非小细胞肺癌显著相关，同时，这些基因mRNA转录水平有不同程度的降低甚至不转录，对辅助诊断肺癌有积极的作用。为下一步临床验证和示范应用打下坚实基础。天津肿瘤医院拥有肺癌新鲜组织标本2700例，肺癌患者血清标本2500例，组织标本和血清配对标本800例，可以用于进行大规模临床试验。（2）在荧光量子点和微流控芯片方面在纳米材料的制备上，已掌握多种制备技术，合成了纳米金、量子点、石墨烯、金属氧化物等多种纳米材料，尤其开发了具有自主知识产权的微波辅助水相量子点制备技术，实现量子点的可控生长和量子点尺寸与分布的精确控制，制备了高质量核壳结构量子点，相关研究成果发表在Adv Mater、Small、Biomaterials、Chem Mater和J Mater Chem等杂志上。通过量子点与生物分子的分子间偶联或自组装，已实现量子点对Avidin、Strepavidin、IgG、DNA等多种生物分子的有序自组装，利用这类具有高亮信号特性和高特异性的“量子点生物分子”复合探针，不仅能成功标记人胚胎期肾细胞HEK293T的骨架蛋白actin，而且量子点的荧光性能和光稳定性均优于荧光染料分子FITC；另外，利用构建的量子点荧光探针QD-IgG或QD-avidin，结合微流控芯片技术，已实现在血清样本中对肿瘤标志物CEA和AFP的高灵敏分析和定量检测，其检测限达到250 fM，比染料探针FITC-IgG提高10000倍，也比常规ELISA提高近10倍。表明基于量子点的微流控芯片不仅具有超灵敏分析能力，而且在血清样本中也具有良好的特异性（Nano Research-2008-v1-p490、ACS Nano-2010-v4-p488、Chem Commun-2010-v46-p6126）。由此可见，利用新型量子点荧光探针，并结合具有“多元多指标”检测能力的微流控芯片技术，是极有可能实现肺癌在临床上的早期诊断。发展了微量样品富集、核酸扩增及电泳分离检测等功能的集成化微流控芯片，在此基础上开发了检测仪器，并用于临床尿蛋白、血脂蛋白的快速分离和分析，其中尿蛋白检测仪可以同时快速检测尿液中多种微量蛋白，用于肾病综合症等重要疾病的诊断，获得医疗器械产品注册证书（注册号：浙食药监械准字2005第2400516）；血脂蛋白检测仪可以同时检测血液中的低密度脂蛋白，用于冠心病等的快速诊断，目前已经完成临床试验，医疗器械产品注册证书正在审批。（3）表面等离子体共振传感器方面制备出孔径可调的三维有序大孔（3DOM）聚苯乙烯基底，建立了一种用3DOM聚苯乙烯材料作为固定生物分子基底的免疫分析新方法。利用衍射峰位移研究了3DOM敏感材料的微流体性质和蛋白质分子在多孔层里的结合过程、结合容量、特异性分子识别反应及检测灵敏度等。制备出能同时耦合金纳米壳（GNPs）的LSPR和光子晶体的衍射光学特性的新型微纳结构敏感材料，该复合材料不仅再现了GNPs的LSPR峰，而且也复制了模板的衍射峰。两个特征峰的可逆叠加呈现出有趣的光学“开关”能力，为监控微环境的改变提供了一个新的三维检测平台。相关工作分别发表在Chem. Mater.、Langmuir上。制备出具有可调光学性质的GNSs，控制GNSs核-壳比可使其LSPR位于光谱的近红外区(700-1300 nm)，该光谱区域是光学传输透过生物组织的最佳区域。将GNSs组装到APTES修饰的玻璃基底表面，制备出新型自组装GNSs敏感膜。利用GNSs对周围介质介电常数改变的敏感性，研制出一种适合于全血样品分析的生物传感器，并实现了全血体系中生物素与链霉亲和素的相互作用的实时检测。相关工作发表在Biosens. Bioelectron.上。（4）硅纳米线传感器方面项目组于2003年发明了一种基于各向异性湿法腐蚀技术的纳米线加工技术，通过采用传统的光刻、刻蚀和沉积技术，利用Si（111）面的自停止腐蚀和硅纳米线的自限制氧化特性，成功地制造了宽度在100nm以下的硅纳米线，并于2005年获得了发明专利。该技术由于完全采用现有半导体工艺，工艺简单，特别适合批量制造的需要。近一年以来，对这种自上而下的硅纳米线开展了表面硅烷化研究，目前已经初步实现了表面自组装单分子膜层，并通过硅纳米线表面单链DNA探针修饰，实现了对1 fM DNA分子的响应。总之，本项目符合国家中长期科学与技术发展规划