克隆抗体和抗体工程.ppt
第四章 单克隆抗体和抗体工程,第四章 抗体制药,第一节 概述第二节 单克隆抗体第三节 鼠源性单克隆抗体的改造第四节 基因工程抗体和抗体工程第五节 抗体诊断试剂第六节 抗体治疗药物,第一节 概述,一、单克隆抗体1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白和丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。,1975年：Khler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。1984年：人-鼠嵌合抗体1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。,单克隆抗体的应用,用于疾病的诊断和治疗：利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗-如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定向治疗。,免疫导向疗法成功障碍：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。,基因工程技术制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。,抗体（antibody）：由B细胞产生的免疫蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链组成。B细胞（B cell）：由骨髓细胞分化而来的能产生抗体的淋巴细胞。单克隆抗体:是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。,第二节 单克隆抗体及其制备,一、抗体的结构与功能,Light and heavy Chain，可变区（variable region），简称V区，3个互补决定区（complementaruty-determining region,CDR）重链分子上有3个恒定区constant region,C区（CH1,CH2和CH3）,轻链上有一个恒定区（CL）。,重链,轻链,用木瓜蛋白酶处理，将抗体分解成3个部分(2个Fab片段和1个 Fc片段)；Fab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链和重链恒定区。CL和CH1之间以二硫键连接；保存有抗原结合活性和特异性。保留VH和VL即可完全获得原抗体的抗原结合活性，FvFc：两条重链的CH2和CH3区域，二硫键连接，没有抗原接合活性，但是抗体结合上抗原后激活免疫反应的主要部位。,接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞,一、杂交瘤技术产生的3个技术关键,1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：,B淋巴细胞(B lymphocytes)：,二、杂交瘤细胞系的生产,骨髓瘤细胞(myeloma cells):,恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。,2.细胞融合技术：,长命不分泌抗体,分泌抗体短命,分泌抗体长命,(Khler和Milstein,Jerne),1984年Nobel生理学及医学奖,3.杂交瘤细胞的筛选,脾细胞(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型,HAT培养基筛选原理(1),细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻断正常的 DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）次黄嘌呤(Hypoxanthine，H):是HGPRT的底物,为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）；胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶(TK)的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料。,核苷酸合成途径-生物合成途径（D途径-主要途径）,主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。,辅助途径：是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA，两种酶缺一不可。,核苷酸合成途径-生物合成途径（旁途径-S途径）,筛选：HAT培养基筛选原理,DNA,内源性途径(D-主要途径),谷氨酰胺 or单磷酸尿苷酸,A,H,T,(Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK),B淋巴细胞：HGPRT+，TK+,骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-,存活,死亡,外源性途径(S-旁路途径),1、未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合,B淋巴细胞：HGPRT+，TK+在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。,骨髓瘤细胞HGPRT，TK在HAT培养液中，因此自身没有“S途径”“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。,2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞,骨髓瘤细胞HGPRT-，TK-既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。,3、杂交瘤细胞,三、筛选阳性克隆与克隆化,（1）筛选阳性克隆：产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右。筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术。免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。,1、精制破伤风毒素抗原（）吸附,（约10g/ml，4，3h）,洗涤,2、加杂交瘤培养上清液（）,（4，1h）,3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4，1h）,洗涤,洗涤,4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔,ELISA用于破伤风抗体的筛选,(ELISA),（2）克隆化有限稀释法和软琼脂法筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。,有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。,软琼脂法：在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入96孔板中继续培养。这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。,三、杂交瘤细胞的鉴定,1）染色体鉴定:正常小鼠脾细胞的染色体数目为 40,而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大，可以有6268 条染色体。2）特性鉴定:对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重要的,一般采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。3）类别鉴定:可以用相应的抗血清及双向免疫扩散法进行鉴定;4）单克隆抗体的纯度鉴定:可以用有还原剂或者无还原剂条件下的 SDS-PAGE 电泳进行鉴定。,四、单克隆抗体的大量制备,（1）体外培养法可获得10g/ml的抗体；（2）动物体内诱生法，可获得520mg/ml的抗体。-目前多采用此法生产制备单克隆抗体。优点：操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。,大量培养方法：利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提高。连续悬浮培养的细胞密度可达2.0107细胞/ml，收集的单克隆抗体可达到400g/ml左右。微载体悬浮培养法，增大单位体积的表面积，利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108细胞/ml。并能收获更多的单抗。,五、单克隆抗体的纯化,动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程1、澄清和沉淀处理小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，去除残留的小颗粒物质；再用0.2m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。2、分离 主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。,2、分离（1）凝胶过滤（2）阴离子交换（3）亲和层析,第三节 基因工程抗体及其制备(Genetic engineering antibody),基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,一、单克隆抗体靶向制剂,2、耦联了tPA的血纤维蛋白的单克隆抗体,(1)药物与单抗直接偶联,通过化学反应在药物分子的氨基和抗体分子的羧基之间形成酰胺键,但由于酰胺键很稳定,药物与抗体分子结合后无法释放出来,因此其药用活性几乎完全无法发挥出来。用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基,然后利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱,最后还原。这样制成的靶向制剂可以保留一定的药物活性,同时体外实验证明,药物显示出一定的选择性。,(2)药物通过小分子与单抗连接,通过一些小分子交联剂,把药物分子上的某些基团与抗体分子上的某些基团连接起来。(3)药物通过大分子与抗体相连 将较多的药物分子接连在一种大分子聚合物上,然后再与单克隆抗体交联。,二、杂交人-鼠单克隆抗体,鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广,鼠源的抗体有其局限性:被清除出人的循环系统;鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统,在大多数情况下,还会引发人对于鼠源抗体本身的免疫反应,人的抗鼠反应(human antimouse resmse),也就是产生人的抗鼠抗体(human antimouse antibody,简称 HAMA)。,Chimeric Antibodies,Human Fc regionsMouse V regions,三、人源化抗体(humanized antibody)1.将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,人源单克隆抗体,化学偶联的单抗靶向制剂产率很低;偶联分子其连接位置也是随机的;药物分子的酶活性和其他生物活性部分、甚至全部丧失。嵌合抗体的可变区100%都是鼠源的，对人体仍然有一定的免疫原性。,传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆抗体主要原因:,人一鼠淋巴细胞的融合细胞中人源的染色体不稳定,得到的人源单克隆抗体极少;没有能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的骨髓瘤细胞;伦理上,无法对人进行多种抗原的免疫。,获得人源抗体的方法I先分离出正在活跃产生抗体的人B 细胞,通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B cell,病毒转化,使之能在培养条件下正常生长。其中的一些转化的 B 细胞就可以分泌出能与特异性抗原结合的单抗。产率很低,抗体对于抗原的结合能力也较差。,获得人源抗体的方法II,将人源免疫干细胞导人缺失大部分免疫细胞的小鼠体内,这种小鼠遇到抗原时,会产生人源的抗体。获得人源抗体的方法III将改造过的人的抗体基因导人鼠胚胎系中,以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。改造过的抗体，除了构成抗原结合部位的轻重链各3个CDR区是鼠源外,其余均为人源的。,Humanized Antibodies,Cloned human geneInsert sequences from mouse monoclonal antibody for CDR1-3 segmentsPCR amplified segments,Isolation of CDR Segments,PCR amplification of CDR segments from mouse monoclonal antibody to desired targetInsert into cDNA clone of human antibodyProduce human antibody with desired CDRs and antigen specificity,四、抗体融合蛋白,一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变区，如用CD4、白细胞介素3和肿瘤坏死因子等。,五、抗体酶,抗体酶(abzyme)：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。抗体酶的制备(自学),Immunotoxins,Protein toxin connected to Fv regionSingle-chain or S-S linked Fv regionToxin localized to antigen-expressing cells,六、单链抗体(single chain antibody)单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。,单链抗体,Fv片段抗体(single chain Fv fragment,scFv)要获得正确的抗原结合构象,VL衔接物VH;单链抗体的应用前景体积小,免疫原性较低,不易引起人体的免疫排斥,渗透性好,能有效地穿透致密的肿瘤屏障,有利于基因治疗。构建双功能分子生物导弹,单链抗体的应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。研究基因结构与功能的关系,七、嵌合抗体(chimeric antibody)嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,八、双价抗体与双特异性抗体(bispecific antibody)许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,九、单克隆抗体的改造和应用,单克隆抗体与杀伤性药物耦联破坏特定的目标细胞;单克隆抗体与药物前体耦联在酶的作用下,可转化为具杀伤活性的药物,杀伤靶细胞,转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全的人源单克隆抗体,轻链和重链各由位于两条染色体上的两组基因分别编码。通过重排产生大量的各不相同的轻链和重链分子。再通过轻链和重链分子之间的排列组合而形成几乎无限的多的抗体分子。,第四节 基因工程抗体和抗体工程,一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。,3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。,二、噬菌体抗体库技术的特点,1、模拟天然全套抗体库抗体文库1011库容，能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。,2、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可获得高亲和力的人源化抗体在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。,三、基因工程抗体的表达,1、原核细胞表达2、真核细胞表达3、转基因植物表达4、转基因动物表达,第五节 抗体诊断试剂,一、血清学鉴定用的抗体类试剂1、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备步骤：（1）制备细菌抗原，O（菌体）抗原，H（鞭毛）抗原；（2）免疫动物和制备抗体血清2、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂3、妊娠诊断试剂4、抗ABO血型系统血清,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,1、荧光抗体诊断试剂荧光色素如异硫氰酸荧光素（FITC）等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。（1）荧光抗体的制备（2）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。,2、免疫酶抗体诊断试剂免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，本法分为免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定（EIA）两种类型。（1）免疫酶染色法用抗体诊断试剂：常用的酶为HRP，其底物为二氨基联苯胺（DAB），两者作用可生成棕褐色沉淀物质，使抗原呈色。（2）酶免疫测定用抗体诊断试剂：见书中介绍的几种试剂，重点掌握酶免疫法的基本概念。比如ELISA方法（夹心法、间接法）。3、放射免疫用抗体诊断试剂,13.4 抗体的表达系统,哺乳动物细胞:具有对蛋白进行正确表达的加工翻译后修饰的能力,能抗体分泌出来。但不能表达完整有功能的抗体。细菌:抗体片段,不能完整地表达抗菌素体,抗体分子遇到不能糖基化、组装错误以及不能形成正确的二硫键；容易形成包函体 抗体片段分子前加上前导序列，可以表达并分泌到胞外。,在重组噬菌体中筛选生产抗体,组合抗体文库常用的表达系统:丝状噬菌体,主要包括大肠杆菌丝状噬菌体、M13、fd、f1。结构特性：单链环状DNA分子;5 种外壳蛋白（、和）；蛋白,位于丝状噬菌体的管状部分,和,分别位于两端;外源基因与外壳蛋白的基因连接;,在丝状噬菌体中表达抗体的过程,丝状噬菌体抗体文库的构建,组合抗体文库的优点,省去了单元克隆抗体制备过程中许多费时费力的过程，改变了制备单隆抗体的思路；使单克隆抗体的制备由细胞水平进入到基因水平，为解决人源单抗体的制备提供了新的途径；重、轻链的随机组合提高了抗体的多样性。,解决分离抗体亲和力较低的抗体的方法：噬菌体展示技术（phage display）：将Fv和Fab片段以多拷贝抗体的形式表达在丝状噬菌体的表面上，这就是。,使用人源可变区制造完全人的基因编码的抗体方法：,基本原理：丝状体的外壳蛋白基因和外源抗体之间引入一个琥珀突变密码子UAG。当丝状体感染有琥珀突变抑制的大肠杆菌株时，UAG密码子被读为Glu，外源蛋白就可以整合蛋白的形式附着于噬菌体表面；则UAG被读为终止密码子，外源蛋白就以可溶性蛋白的形式被分泌到细菌体外。,
