克隆基因的表达.ppt

,原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：,原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。,pIJ486 是链霉菌的质粒（如下图所示），其中 neo 和 tsr 分别为新霉素和硫链丝菌素的抗性基因。为了准确克隆并筛选出目的 DNA 片段的克隆，最为理想的插入位点是？说明其原因？,位点为tsr内的EcoRV。当外源基因插入EcoRV位点时，硫链丝菌素基因失活。利用新霉素来筛选重组子。,怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?,化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。,列举两种外源基因转化的方法?如何提高其转化效率?,CaCl2处理后的细菌转化或转染：低温和CaCl2处理制备感受态细胞，使细胞膜通透性增加，处于容易捕捉和接受外源DNA 的状态。电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。,质粒的大小，拷贝数；受体细胞的状态；转化的外在条件，如温度等;质粒与宿主菌的比例。,建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?,1 基因表达的机制,1.1 外源基因的起始转录,外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。,原核生物启动子,诱导型启动子：,组成型启动子：,如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子,如T7噬菌体的启动子,真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。,mRNA的延伸与稳定,外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。,一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。,外源基因mRNA的有效翻译,外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：,AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。,不同基因组使用密码子具有选择性。,主密码子（major codon）,罕用密码子（rare codon）,如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。,1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性,避免外源基因表达蛋白降解的对策：,构建融合蛋白表达系统,构建分泌蛋白表达系统,构建包涵体表达系统,选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,1.5 目的基因沉默,基因沉默的作用机制,位置效应的基因沉默：,转录水平的基因沉默：,转录后水平的基因沉默：,是指基因在基因组中的位置对其表达的影响,是在DNA水平上的基因调控,是在RNA水平上的基因调控,第七章 克隆基因的表达,基因激活,转录起始,mRNA水平,蛋白质水平,克隆基因的表达,第一节 基因表达的基本过程第二节 外源基因在原核细胞中的表达第三节 外源基因在真核细胞中的表达第四节 提高外源基因表达效率的途径,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。,第一节 基因表达的基本过程,基因表达的基本过程,基因表达的基本过程,基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messenger RNA)；,然后，tRNA（转运RNA,transfer RNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。,基因表达机制,1.外源基因的起始转录,外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤，转录起始的速率是基因表达的限速步骤。因此，启动子是关键。,2.mRNA的延伸和稳定性,外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。另外，mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。,思考:,基因表达与克隆基因表达的异同?,表达的对象、过程、场所,克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,基因激活,转录起始,mRNA水平,蛋白质水平,原核中表达,真核中表达,外源基因,用原核生物作宿主。,A dividing E.coli,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。,数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。,一、原核生物基因表达的特点,2.以操纵子为单位,1.只有一种RNA多聚酶,乳糖操纵元（lac operon）的结构,lacI,lacZ lacY lacA,PlacI Plac Olac,RNA,DNA,lacZ lacY lacA,lacI,乳糖阻遏物（单体、四聚体）-半乳糖苷酶 渗透酶 乙酰转移酶,Protein,乳糖 葡萄糖半乳糖,增加乳糖的吸收 功能未知,有意义链,5,反意义链,3,转录,mRNA,5,3,翻译,蛋白质,N,C,5,3,3.转录和翻译偶联、连续进行。,4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。,5.调控主要在转录水平上。,含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,6.mRNA的核糖体结合位点,Shine-Dalgarno（S-D）sequence:,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,二、原核表达系统的注意事项,外源基因不能带有内含子。,2.必须用cDNA,3.不能直接用真核基因组DNA。,4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）,5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。,为何？,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,大肠杆菌基因表达载体基本结构特征,三、原核生物基因表达的调控,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,1.启动子,-35 Box 和-10 Box,（1）启动子序列,consensus sequences,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-10box（Pribnow Box）,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,RNA聚合酶 亚基的识别位点。,-35box,原核启动子共有序列的功能,2 翻译的起始位点,核糖体结合位点（RBS）,1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,ribosome binding site,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）,位于SD序列下游。,ii）起始密码：,全酶是一个5聚体，含有两个小亚基，和2两个大亚基（和），一个亚基。,3 RNA多聚酶,大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,结构,4.转录终止子,内终止子,intrinsic terminator：,E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。,在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,启动子,操纵子,S-D序列,目的基因,终止子,由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,终止形成的原因：,反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作,茎环结构,多聚A/U,5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板),转录,5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA),RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脱落,大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。,5.翻译终止密码,6.翻译增强子,Translation enhancer,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。,T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,21,1 基因表达的机制,1.1 外源基因的起始转录,外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。,原核生物启动子,诱导型启动子：,组成型启动子：,如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子,如T7噬菌体的启动子,真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。,必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。,应呈现低水平的基础转录,便于表达毒性蛋白等。,应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,最佳启动子必须具备的条件,7.基因工程常用的原核启动子,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,（1）包涵体（inclusion body）,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,形成原理未知。,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone,hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。,缺点,优点,2.周质中表达,（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚,优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,3.胞外表达,或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点,五、几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,缺点：,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,举例：pKK223-3 载体,组成结构：,强启动子:tac（trp-lac）:,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,操纵基因：,乳糖操纵子系统。,终止子：,调节基因：,Lac I,宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌。,rrnB的强终止子,rrnB强终止子,S-D,插入位点区,S-D序列和插入位点区：,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,载体的其余部分：,来自pBR322质粒。,表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,阻遏物,IPTG,启动子,载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,2.分泌型表达载体,pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,（1）组成结构,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。,调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG。分泌信号肽：,大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。,插入位点区（多克隆位点）。,强启动子：,pIN III-comA1,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,启动子：tac 操纵基因：lacP 调节基因：lacI S-D序列,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,（1）优点,（2）组成结构,便于融合蛋白的分离和纯化。,22,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,ori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,（3）产物提纯,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,（5）其他融合蛋白系统,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,人胰岛素在大肠杆菌中的表达,溴化氰,Cyanogen bromide：,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-35box,-10box（Pribnow Box）,六、影响外源基因表达效率的因素,1.启动子的结构对表达效率的影响,RNA聚合酶 亚基的识别位点,（1）一致顺序,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为17bp时，启动子最强。,（3）-35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，启动子越强。,5-TTGACA,TATAAT,一致顺序,lac,trp,PL,recA,tac I,tac II,5-TTTACA,TATGTT,5-TTGACA,TTAACT,5-TTGACA,GATACT,5-TTGATA,TATAAT,5-TTGACA,TATAAT,5-TTGACA,TTTAAT,-35box,-10box,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。,2.转译起始序列对表达效率的影响,（1）S-D序列,？,SD 序列与16Sr分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的转译速率当序列为，可与16Sr端完全互补，转译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，转译效率便会下降倍,AUG左侧的三个碱基也有影响。,（2）起始密码AUG,-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,AUG右侧的三个碱基也有影响。,多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。,（3）其它,终止子能有效控制目的基因mRNA的长度、提高mRNA的稳定性,3.启动子与外源基因之间的距离,转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。,增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。,4.转录终止区对表达效率的影响,5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响,6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,选择强启动子序列，如tac 等,七、提高表达水平常用的方法,2.调整S-D序列与AUG碱的距离,距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。,3.改变起始密码下面的几组密码子,一般为5-9bp。,能提高翻译的起始效率。,4.增加mRNA的拷贝数和稳定性,在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻击。,5.减轻宿主细胞的代谢负荷,合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。,将宿主生长代谢与外源基因表达分开。,（1）诱导表达,一般采用温度诱导或药物诱导。,cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。,32C:,42C:,cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。,cI857,PL,外源基因,PO,PL启动子是温度诱导型,调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。,无IPTG:,阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。,有IPTG:,阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,tac启动子是药物诱导型,（2）表达载体诱导复制,将宿主的生长与载体的复制分开。,当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。,（1）设计成融合蛋白,这是避免被降解的最好措施。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,6.提高表达产物的稳定性,防止被宿主的酶降解。,Z系列载体：,ZUV5载体:,lac Z,G,AATTC,CTTAA,G,外源基因,Z2载体:,lac Z,GGG,AATTC,CCCTTAA,G,外源基因,Z3载体:,lac Z,GG,AATTC,CCTTAA,G,外源基因,提供三种融合插入阅读框。,使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,（3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,细菌蛋白分泌的条件：,位于N端，一般为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似，可以互换。,碱性氨基酸,N,疏水氨基酸核心区,切割位点,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信号肽酶,外源蛋白,有信号肽。,细胞内的转运机制。,真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。,蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。,为蛋白指明目的地。,23,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、原核表达系统,原核基因表达,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。,1.形成正确的二硫键,人胰岛素分子,抗体分子,人血红蛋白分子,如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。,2.前体切割,（1）O-糖基化（Ser,Thr）,增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。,3.蛋白质糖基化,糖基,（2）N-糖基化（Asn）,Dol：长醇,Mannose：甘露糖,Glucose：葡萄糖,N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、细菌表达载体举例,原核基因表达,1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统。（如糖基化、氨基酸修饰等）。,十、原核细胞表达的缺陷,2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变形、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。,3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。,一、原核生物基因表达的特点,二、原核表达系统的注意事项,三、原核生物基因表达的调控,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,六、影响外源基因表达效率的因素,五、几种类型的原核表达载体,七、提高表达水平常用的方法,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,十、原核细胞表达的缺陷,八、原核表达系统,原核基因表达,原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：,原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。,6.3.1 大肠杆菌基因表达系统,大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。,与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：,经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。,常见的大肠杆菌表达系统,Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。,PL和PR表达系统：是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。,T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。,2 芽孢杆菌表达系统,芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌和短小芽孢杆菌等。,利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：,许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。,6.3.2.1 芽孢杆菌表达载体,复制子,金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等,短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等,含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。,短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。,启动子,芽孢杆菌含多种转录起始识别因子（）。芽孢杆菌启动子的表达具有明显的时序性，它与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。,表达载体,自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢杆菌中进行自主复制。,整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。,噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。,6.3.2.2 宿主菌,常用的宿主菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,6.3.2.3 外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达,芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。,6.3.2.4 在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略,提高表达质粒在细胞中的稳定性,灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶,6.3.3 链霉菌表达系统,链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质。,链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：,为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。,6.3.3.1 链霉菌基因表达载体,启动子,结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：,与大肠杆菌基因-10区和-35区类似的启动子,仅与大肠杆菌基因-10区类似的启动子,与大肠杆菌基因-10区和-35区序列均不相同的启动子,终止子,具有较长的不完全互补反向重复序列。,核糖体结合位点,密码子,链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达66、53和93，而该现象不存在于非编码区。在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2。密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高于G的频率。,类似于其它原核生物的SD序列：5(A/G)GGAGG3。,6.3.3.2 宿主菌,变铅青链霉菌,天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。,变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源DNA无明显的修饰作用；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。,主要有,6.3.3.3 外源基因在链霉菌中的表达（自学）,异源重组蛋白的分泌表达次级代谢产物合成酶基因表达,6.3.3.4 在链霉菌中高效表达外源基因的策略（自学）,影响外源基因在链霉菌中表达的因素,启动子的特性,信号肽的序列,基因的结构,发酵条件,6.3.4 蓝藻表达系统,蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统(PS)和光合系统(PS)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。,蓝藻与真核生物藻类最大的区别是：它无叶绿体，无真核，有70S核糖体，细胞壁中含有肽聚糖，因而对青霉素和溶菌酶十分敏感等。,6.3.4.1 蓝藻外源基因表达载体（了解）,6.3.4.2 用作外源基因表达的宿主蓝藻,蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：,基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。,蓝藻在各生长时期均处于感受状态，均可用于转化，但通常采用对数生长中期到后期的细胞进行转化。转化过程中遮光或添加光合作用抑制剂可提高转化效率。,6.3.4.3 外源目的基因在蓝藻细胞中的表达（略）,6.3.4.4 在蓝藻细胞中高效表达外源目的基因的策略,构建在蓝藻细胞中稳定性好的表达载体系统。组装含强启动子的外源基因表达盒。外源基因融合表达。,