鱼类多倍体育种技术及应用.ppt

鱼 类 多 倍 体 育 种 技 术 及 应 用,自1945年Sv rdson首先发现鲑科鱼类中存在多倍体类型起，在做过染色体研究的1600多种天然鱼类中，人们发现多倍体鱼类至少有150种(或亚种)以上。,黑龙江流域与西伯利亚的银鲫的某些种群为三倍体种群；河南省的淇河鲫、美国的溪红点鲑等也是天然三倍体；日本的四倍体关东鲫和大泥鳅也是天然种群；,人工多倍体是用人工的方法诱导形成的，通过多倍体育种可培育出新的品种，是现代育种的一种新方法，目前已在生产上广泛应用。,多倍体鱼类与二倍体鱼类不同的特性：生长快、个体大、性腺发育异常、寿命延长和遗传特性改变等。,可概括为：1）巨型性：细胞容积大于二倍体，因此个体较大；2）速生性：生长快，提前达到商品鱼的规格（营养体的生理性旺盛，不能等同于发育快）。水生所的三倍体鲤生长快于杂交鲤，因此三倍体鲤不仅有二倍体杂交鲤的杂交优势，而且生长速度超过二倍体。,3）克服远缘杂交不育性：异源多倍体能大大提高远缘杂交的受孕性，异源多倍体的后代基本上没有分离现象。用多倍体鱼类作杂交亲本，所产的杂种优势比用二倍体鱼类作亲本时维持的时间要长。,4）增强抗逆性：一般多倍体鱼的抗病性、耐寒性比相同的二倍体鱼类要强。5）生理生化方面的变化明显：用药物处理，经过诱变所得的异源多倍体的蛋白质含量显著提高。当然也存在着一些不足：如某些种类制种和大批量生产有难度，规模化生产的成本问题等。,显然，这些特性如果能为生产所用的话将有利于提高养殖产量和效益，因此了解和掌握鱼类多倍体育种技术具有十分现实的意义。,鱼类和虾蟹类的多倍体可以采用物理和化学的方法由人工诱导而成。目前利用染色体组操作技术生产人工多倍体水产经济动物的研究已取得令人瞩目的成就。,已有20余种海洋经济贝类、近10种十足类甲壳动物如中国对虾Penaeus chinensis、日本绒螯蟹Eriocheir japonicus中华绒螯蟹Eriocheir chinensis以及40余种鱼进行过人工诱导多倍体的研究并获得了成功。,鱼类人工多倍体的研究-20世纪70年代后得到迅猛发展。三棘刺鱼、鲽、川鲽、大菱鲆、鲤鱼、鲢、虹鳟、鳙、白鲫等20多种鱼类中获得多倍体试验鱼。海水鱼仅进行了黑鲷、牙鲆三倍体，真鲷三倍体、四倍体等的基础研究。,本课程拟对鱼类多倍体产生的机制、人工诱导方法、性状及应用前景作一综合性介绍。,1 鱼类多倍体产生的机制 原理：细胞正常的有丝分裂特点：当细胞进行有丝分裂时，染色体组经过复制加倍，被纺锤丝拉向两极，中间形成隔膜，使一个细胞分裂变成染色体组与原来相同的两个细胞。,如果我们利用某些理化因素，在细胞分裂中期阻止纺锤和中间隔膜（细胞板）的形成，而使已复制的染色体不能分向两极，不能在中间形成隔膜，结果就形成了染色体组加倍的细胞。,如果这时理、化因素消失，那么这个细胞再分裂形成的细胞便有了加倍的染色体了。以这样的细胞形成的组织、器官和由它产生的后代就是多倍体了。,染色体的加倍也可以通过保留受精卵第二极体即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵裂来实现。,鱼类受精细胞学研究表明：鱼类精子入卵的时期是第二次减数分裂的中期，卵子受精后放出第二极体。如果设法抑制第二极体的放出即形成二倍体卵，二倍体的卵原核与正常精原核结合就形成三倍体；,如果卵子受精后:排出第二极体形成单倍体卵单倍的卵原核与单倍的精原核结合形成二倍的受精卵 在这时再抑制受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体。,三倍体育种的方法：在减数分裂过程中处理卵母细胞，阻止减数分裂过程中第一极体或第二极体放出，阻止卵细胞的染色体减半，从而产生2n的卵细胞。2n的卵细胞与正常减数分裂产生的精子(1n)结合，产生3n的受精卵，其结果可发育成三倍体个体。,三倍体育种的方法：在减数分裂过程中处理卵母细胞，阻止减数分裂过程中第一极体或第二极体放出，阻止卵细胞的染色体减半，从而产生2n的卵细胞。2n的卵细胞与正常减数分裂产生的精子(1n)结合，产生3n的受精卵，其结果可发育成三倍体个体。,四倍体育种的方法则是在合子进行第一次有丝分裂时实施刺激，阻止第一次有丝分裂，结果可形成四倍体,A A,A-A A-A,A-A,A-A,A,A,A,A,第一次分裂,第二次分裂,卵母细胞的正常减数分裂示意图,A-A代表细胞复制后含有二条染色单体的一条染色体,A代表细胞中的一条染色体；,A A,卵母细胞,A A,A-A A-A,A-A A-A,A A,A A,阻止第一极体放出,产生三倍体的示意图a,经过减数分裂后的精子A,A A,三倍体A A A,A A,A-A A-A,A-A,A-A,A A,A A,阻止第二极体放出,阻止第二极体放出,产生三倍体的示意图b,经过减数分裂后的精子A,A A,三倍体A A A,A A,A-A A-A,A A A A,阻止第一次有丝分裂,四倍体产生的示意图,A A,受精卵,2 诱导多倍体鱼类的方法人工诱导鱼类多倍体的方法主要有生物、物理和化学方法三种。,2.1 生物学方法 远缘杂交、核移植及细胞融合是采用生物方法诱导鱼类多倍体的有效途径。Marian等(1978)最早发现草鱼鳙之间的杂种是异源三倍体;,（同源多倍体：各染色体组的内容相同，来自同一物种（AA）（AAAA），同源多倍体与原来的二倍体具有相同的遗传物质，只是在数量方面加倍罢了；,异源四倍体是可育的，而不加倍的（AB）可能是杂种不育。异源四倍体或是同源四倍体，也具有可育性）。,（AA）,（BB）,（AABB）,（AAAA）,（BBBB）,（AABB）,异源多倍体：染色体组内容不相同，来自不同物种,也称双二倍体。,（AA）,（BB）,（AB）+（AB）,鱼类的远缘杂交可能产生单倍体、二倍体和多倍体(Chevassus 1983)。用雌性草鱼(2n=48)与雄性三角鲂(2n=48)杂交，获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体(刘思阳 1987)。,用异育银鲫与兴国红鲤杂交获得复合四倍体(种间杂交)，第二极体排放受到抑制从而产生多倍体，而种内杂交很少有不排出第二极体的,其机理尚需进一步探讨；,核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段，用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎，该技术的成熟很可能成为诱导四倍体鱼类的有效途径之一,细胞融合主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合，,但由于细胞内染色体发生重排，实际得到是含各种不同数量染色体的鱼类细胞群。但利用这一技术可以探索改良品种的可能性。,2.2 物理学方法 主要包括温度休克法静水压法，高盐高碱法电休克法。,物理学方法机制主要是通过破坏微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形成多倍体细胞。,2.2.1 温度休克法 即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休克法。一般冷水性鱼类如鲑科鱼类，通常用热休克，温度范围为2836；,温水性鱼类可以用热休克，也可用冷休克，温度范围为010左右。鲤鱼用热休克可以获得较高比例的三倍体，香鱼三倍体的诱导用冷、热休克均可获得令人满意的结果。,进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间持续时间以及温度高低鱼类温度休克敏感性的差异除了遗传背景外，还与卵子成熟度有关。,美洲红点鲑卵受精后15min用28高水温热休克处理10min，可诱导出100%的三倍体，孵化率42%。日本山口县外海水产试验场在水温15条件处理牙鲆受精卵4min，诱导出100%的三倍体牙鲆。,实例：日本学者1943年将受精后10分钟的鲤鱼卵用0.53处理1030分钟可获得三倍体；英国专家1972年对鲽鱼与川鲽杂交的受精卵（受精后15分钟）用0进行休克3.5小时，获得100%的三倍体并养成了成鱼。,美国Valenti(1975)对奥里亚罗非鱼的受精卵进行冷休克处理，获得三倍体鱼。方法是将正在排卵的雌鱼捕出进行人工挤卵，加入精液，受精后14分钟后在11水温下处理1小时，再转入32条件下孵化成鱼苗，多倍体获得率为75%。,水生所将受精后3分钟的鲤鱼卵用01.5的水温处理30分钟获得2025%的三倍体。草鱼与团头鲂杂种受精卵在有受精后5分钟在02下进行冷处理20分钟，获得57%的三倍体，还有14%的四倍体。,如果从受精后44分钟开始处理，持续时间2634分钟，四倍体获得率为3040%。草鱼卵用相同的方法处理可获得30%左右的三倍体。,2.2.2 静水压法(637-650kg/cm2)抑制第二极体的排出或者抑制第一次卵裂。该方法最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，对受精卵的损伤小，处理35min,诱导率高(一般在90%100%)。但需专门的设备如水压机等，同时样品室容量有限，不适宜大规模生产。,Streisinger等(1981)用静水压阻止第二极体排出，同时用乙醚阻止受精卵的第一次有丝分裂，从而产生纯合二倍体雌核发育斑马鱼。桂建芳等(1990)采用静水压处理获得了批量三倍体和少数四倍体彩鲫。,2.3 化学方法 所采用的化学药品主要有秋水仙素细胞松驰素B(CB)聚乙二醇(PEG)6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)。,这些化学药物对染色体的运动并无影响，主要通过阻止分裂沟的形成抑制细胞质的分裂阻止极体的释放而形成多倍体。,秋水仙素能阻止有丝分裂细胞中纺锤的形成，使已经纵裂了的染色体不能分向两极，当药物消失后，恢复常态，受精卵重新进行正常分裂，但此时细胞内染色体数目却因此而增加了，从而形成一个染色体加倍的重组核。,用0.01%秋水仙素浸泡处于第一次卵裂前的溪红点鲑Salvetinus poutinatis受精卵产生了多倍体以及多倍体与二倍体的嵌合体。,水生生物所(1976)也曾用50100ppm秋水仙素处理草鱼团头舫杂种（2-4细胞期胚胎）受精卵20分钟，获得一定比例的三倍体和四倍体。,0.02%秋水仙素处理鱼卵1小时可全部杀死鲤鱼卵。用秋水仙素处理容易形成嵌合体且成活率较低，人们常用秋水仙碱与种间杂交相结合诱发异源多倍体。,细胞松驰素B是一种细菌的代谢产物，细胞松弛素B法(简称CB法)它能抑制肌动蛋白聚合成微丝，干扰细胞分裂从而产生多倍体。这一方法应用也较广，但细胞松弛素B法易产生镶嵌体和畸型胎。,用浓度10mg/L的细胞松驰素B(溶解于2.5%DMSO)处理大西洋鲑Salmo salar的受精卵获得二倍体、三倍体和四倍体的嵌合体，但以三倍体为主。,Refstire(1981)用浓度为1g/mL CB溶液(0.1%DMSO)处理虹鳟受精卵3040h直至4胞期，也获得了多倍体与三倍体的嵌合体，但以四倍体为主。尽管细胞松驰素B的诱导效果较好，但因是致癌剂，影响了它的使用推广。,聚乙二醇是一种常见的细胞融合剂，Ueda等(1986)用聚乙二醇处理虹鳟的精子，然后让其与卵子受精，三倍体虹鳟胚胎获得率为40%。,6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)自1993年开始广泛应用于诱导贝类多倍体，其低毒、高效、价格便宜，但目前还没有用来诱导鱼类多倍体的报道。化学药品一般较贵，而且有毒性，诱导的多倍体往往是嵌合体，不如温度休克与静水压处理诱导鱼类多倍体使用普遍。,3 鱼类多倍体的倍性鉴定诱导形成的鱼类多倍体需要进行染色体倍性的测定。测定的方法主要分为两种：直接方法：染色体计数和DNA含量测定等。间接方法：细胞测量、蛋白质电泳、生化分析和形态学检查等。,多倍体鱼具有体型较大的特点，如鳞片、体长、体高、鱼鳍以及红血球核特别大，从外形上也可辨别其可能是多倍体。检查不育远缘杂种的可育性，如果可育，说明染色体已加倍。,对于卵裂至囊胚晚期或至肠胚早期的受精卵用染色体制片直接计数测定；刚孵化出的仔鱼则用红血球核体积和核面积测量计算测定较为合适；,到鱼苗乃至成鱼如保留活体则可采用取血测量红血球体积、测定DNA含量、蛋白质电泳法（血清蛋白的差异），或剪下鳍条进行蛋白质电泳、生化分析以及外部形态学观察测定。当然也可取鱼肾脏做染色体制片，进行染色体计数以及蛋白质电泳分析来测定。上述方法中染色体制片直接计数法是最直接和精确的鉴定方法。,4 诱导鱼类多倍体技术在水产养殖上的应用4.1 控制过度繁殖湖泊等一些养殖水域，需要合理的放养种群及密度，以维持良好的生态环境。为了有效控制某一种群的过度增生，避免造成对环境的破坏，采用放养不育的三倍体鱼类可解决这一问题。,如草鱼虽可控制杂草的生长，但草鱼的天然繁殖能力强，易造成对水生植物的毁坏，用人工诱导的方法产生具有消耗杂草能力的不育三倍体草鱼乃是很有效的途径之一。,4.2 提高生长速度原理：利用三倍体鱼的不育性，使原来用于性腺发育的能量被用作体细胞的生长，因而成体三倍体的生长速度普遍超过二倍体。三倍体泥鳅最初2个月生长速度和二倍体一样，但45月龄后生长速度超过二倍体的20%30%(Kim等，1994)；三倍体斑点叉尾在2月和4月龄时与二倍体生长速度差不多，13月龄后生长速度比二倍体快15%左右(Wolters等，1982)。具有极好的潜在经济价值。,4.3 延长鱼类寿命一些鱼类在繁殖期间会遭受损失甚至全部死亡，如大麻哈鱼产卵后通常死亡，虹鳟在缺乏产卵支流的湖泊中会有很高的死亡率。三倍体鱼类因性腺不能充分发育，避开繁殖期，从而避免了繁殖期死亡。此外，一些研究者认为，三倍体鱼类的口感及出肉率较高，如虹鳟三倍体的口感明显优于二倍体(张涌泉，1989)。,5 甲壳动物多倍体育种的进展情况 近年来，已对五种十足类进行了多倍体育种研究。相建海等用CB和温度休克两种方法成功诱导了中国对虾多倍体个体。与对照组相比，实验虾平均生长都较快。包振民等用细胞松弛素B法诱导出了中国对虾三倍体。中华绒整蟹多倍体和日本沼虾的多倍体研究亦有报导。,6 处理方法与多倍体诱导率及成活率的关系 细胞松弛素与物理因素(温度和压力)相比，有可能得到更高的三倍体诱导率、这是因为细胞松弛素抑制细胞膜微丝网状系统的形成，细胞不能进行分裂，但不影响细胞内的核分裂。而温度和压力同时抑制微丝和微管，这既阻止染色体运动又阻止细胞分裂。但这只是基于理论上的分析，尚缺乏实验证明。,一般认为不管哪一种方法、如果能摸清三要素的优化处理条件：处理起始时刻持续时间处理强度(浓度、温度等)诱导率都会提高。,一般认为囊胚期胚胎的成活率与处理起始时刻的关系不甚明显，但持续时间延长和温度过高(热休克)或过低(冷休克)或细胞松弛素浓度过高会导致成活率降低。通常认为，多倍体胚胎死亡的主要原因是由于离体培养时环境条件未能很好地满足其发育需求所致；另有一些学者认为，多倍体胚胎死亡的主要原因可能与诱导因子对卵子造成损害有关。,在日本沼虾多倍体育种研究中，采用直接处理自然交配的抱卵亲虾(受精卵由母体携带孵化条件下)：不同刺激强度和不同持续时间的多组实验胚胎均大量死亡，而对照组则少有死亡。因此，可以认为诱导因子对卵子的损害很可能是胚胎死亡的主要原因，而胚胎发育过程中环境因子为次要原因。,7 甲壳动物多倍体育种过程中所遇到的问题7.1 处理起始时刻的确定 这是多倍体育种的关键，因为不论是诱导三倍体还是四倍体，都必须在细胞分裂的某一时刻阻止细胞分裂或染色体的分离和分配。,进行三倍体诱导育种时，要掌握减数分裂第一、第二次分裂的确切时间，以便及时处理，同样诱导四倍体应该掌握第一次卵裂的确切时间。但是，不同生物的卵母细胞进行减数分裂和第一次有丝分裂的时间和过程有明显的差异，即使同种生物，在不同的生活环境下(如温度、水质、营养状况等的差异其减数分裂和第一次有丝分裂的时间也会不同。,7.2 有效诱导率的提高 温度休克法诱导多倍体时，要考虑处理的最佳温度和持续时间。温度过高(热休克)或者过低(冷休克)，都会对受精卵造成伤害导致胚胎的死亡率提高，无法得到大量的多倍体个体。同样，如果处理时间过长，也会导致上述结果。,用细胞松弛素法诱导，则要考虑处理的浓度和持续时间。浓度过低或时间过短，处理无效；浓度过高或时间过长，又会使细胞染色体的非整倍体增多和畸型率增多因而，要提高有效诱导率必须找到适宜的处理温度(温度休克法)或细胞松弛素B浓度和持续时间。,用冷休克法诱导日本沼虾多倍体时，在相同的持续时间情况下，7、8月份的最适诱导温度要明显高于4、5和10、11月份。这是因为7、8月份养殖亲虾生活在高达32的水温中，而4、5、10及11月，水温则为22左右,因而，我们认为除了遗传背景外，受精卵对温度的敏感度还可能与环境背景有关。由于生存的需要，在环境温度较低时，生物机体调节自身的生理机能和代谢状况以适应较低的温度。因而对低温的耐受性强，其亚致死温度会低一些；而当环境温度高时。其机体又通过调节以适应较高的温度。亚致死温度也相应提高。,7.3 抱卵特性对诱导和胚胎发育的不利影响 多数甲壳动物具有抱卵的特性。这给多倍体诱导育种带来许多不便。首先、由于卵在雌虾腹部的位置不同，会造成卵的发育不同步，处理时就不能达到预定的专一诱导目的。,其次，有些甲壳动物的抱卵期较长，这使因诱导而有所损伤的胚胎在发育过程中更易受到外界环境不利因素的影响，引起胚胎的大量死亡，使诱导率大大降低，甚至导致胚胎全部死亡。,以上这些难点的存在，直接影响了甲壳类动物多倍体育种技术在生产上大规模的应用，因而都亟待解决。,多倍体育种研究的发展方向 以前的多倍体育种的研究主要注重对三倍体诱导的研究。但不育的三倍体虽能增产，但难以在生产上推广应用，这是因为它不能产生后代，经常制种生产成本较高，也不切实际。最理想的方式是先诱导四倍体，四倍体具偶数染色体，再与正常二倍体进行交配产生三倍体，可实现三倍体个体的批量化生产这是今后努力的方向。,