血清清蛋白的分离、纯化和鉴定.ppt

淀粉酶活性的测定,一、实验目的,掌握测定淀粉酶活性的原理熟悉测定淀粉酶活性操作方法,方法一：3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性,一、实验目的,1.掌握用3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性的方法2.熟悉3，5-二硝基水杨酸测淀粉酶活性的原理,二、基本原理,1、测量依据,淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水解,产生还原糖淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比，可以单位体积样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。,2、相关反应:,：淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸。具体反应式为：,三、操作步骤,实验设备试管，滴管，容量瓶，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，电磁炉。,1.实验设备：,三、操作步骤,（1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液；,实验试剂及其配制：,（3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入；麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中；（5）pH 6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。（6）0.4mol/L的NaOH溶液；（7）淀粉酶溶液,三、操作步骤,实验步骤淀粉酶活力测定(1)取试管：取试管4支,2支为对照管,2支为测定管。(2)装溶液：在2支对照管中分别加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。(3)加试剂：在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液和淀粉酶溶液lml。,基本操作,(4)保温：将4支试管置另一个37 恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入37下预热的1淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入37恒温水浴保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。,麦芽糖的测定：,(1)标准曲线的制作:取试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1,置沸水浴中加热10min，取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线,（操作的关键环节）,样品的测定:取酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加入2m1 3,5-二硝基水杨酸试剂。置沸水浴中加热10min.取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。,计算公式：,相关实验,一、实验拓展,方法二：碘-淀粉测定淀粉酶活性,一、实验目的,掌握测定淀粉酶活性的原理熟悉测定淀粉酶活性操作方法,二、基本原理,原理：淀粉酶催化淀粉分子中-1,4糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖及糊精。利用已知浓度的淀粉溶液作为底物，加入一定量的淀粉酶，在适应条件下淀粉酶将部分淀粉水解。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与淀粉的浓度成正相关,用分光光度计法测出反应后淀粉的浓度，从而推算出单位体积样品在一定时间内消耗淀粉的量。,五、讨论,依据血清电泳的结果作为阳性对照，判断盐析过滤液中有无清蛋白。,分析所获得的清蛋白纯度,分析有无分离获得清蛋白,根据层析液样品电泳结果中杂蛋白条带出现的情况，判断分离的清蛋白纯度。,六、结论,