质粒DNA的提取酶切及浓度检测.ppt
实验5 质粒DNA的提取,质粒的概念,质粒：质粒是细菌染色体外的遗传物质，大小在1200kb之间，大多是具有双股闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。,质粒提取目的,PCR的模板质粒作为克隆载体(研究目的基因时，常需要提取质粒),质粒提取的方法与原理,碱裂解法SDS裂解法煮沸裂解法氯化铯-溴化乙锭梯度离心法试剂盒法,碱裂解法溶液1 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。溶液2 0.2mol/L NaOH,1%SDS溶液3 乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，28.5mL H2O,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1 充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒3-5次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,加入150 l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒3-5次混匀，冰上放置5min;用台式高速离心机，12000r/min离心15min，上清移入另一干净离心管，并加2倍 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,质粒小抽试剂盒,原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。优点：操作简便、节约时间、性/价比高。,使用者需备,10,000 xg以上高速离心机1.5ml的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇,注意,一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNase A，二、浓缩的Wash Buffer需用乙醇稀释：三、稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操作。,实验操作步骤,增殖细菌、扩增质粒裂解菌体、获取质粒抽提质粒、分离纯化结果鉴定,对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带 1）（松弛）螺旋状质粒DNA带 2）超螺旋状质粒DNA的带以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。,质粒DNA提取范例：,质粒DNA的酶切鉴定,1.实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。,2.相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,1)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：型 型*型,II型 限制性内切酶 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。,这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和表示在双链上交错切割的位置,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,2)影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的 pH值。,3.实验材料与仪器质粒 标准分子量片段(DNA Ladder)EcoRI 和 Hind 核酸内切酶（Takara）EcoRI和 Hind 酶解缓冲液(10M buffer)琼脂糖,TBE或TAE缓冲液(10)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上样液(6)：0.25%溴酚兰，40(W/V)蔗糖 水溶液。,缓冲液 因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。,EcoR I 酶切位点：GAATTCHind 酶切位点：AAGGCT,*缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 M buffer。,置于37水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分别加入3l的上样缓冲液,然后进行电泳分析。,1)质粒DNA的酶解,4.实验方法和步骤,实验结果,未酶切质粒；2.EcoRI 单酶切；3.EcoR1+Hind 双酶切M.DNA Marker.,
