血红蛋白的提取与分离I.ppt

课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,教学目标教学重点教学难点,理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的分离样品处理凝胶色谱法的原理电泳法分离大分子的原理,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,一、基础知识蛋白质提取和分离原理,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质：,形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,1.凝胶色谱法,（1）原理：（2）材料,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,1.凝胶色谱法,（3）分离过程,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等,1.凝胶色谱法,（4）缓冲溶液洗脱剂组成：配制：作用：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,2凝胶电泳法：,（1）原理：,不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,影响蛋白质分子运动速度的因素,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,2凝胶电泳法：,（2）分离方法：（3）分离过程：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,4.透析血红蛋白,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,粗分离凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,3.样品的加入和洗脱,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,注意事项,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,知识总结,血红蛋白的提取和分离,课题3 血红蛋白的提取与分离（II）,课题3 血红蛋白的提取与分离（I）,影响蛋白质分子运动速度的因素,