血清醋酸纤维素薄膜电泳.ppt
血浆蛋白质 醋酸纤维素薄膜电泳,实验目的,1、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质 的实验操作技术和注意事项。3、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳 的优点及使用范围。,醋酸纤维素薄膜电泳,采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120m，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。,醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用,具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。,原 理,血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白，纤维蛋白原条区带。,血浆蛋白质的等电点、平均相对分子量、及正常含量,球 蛋 白,实验材料,健康人血浆或动物血浆,试剂,1、pH8.6巴比妥缓冲液2、氨基黑10B染色液3、漂洗液4、洗脱液5、透明液（试剂配制参见实验讲义）,定量时用,仪器和器材,1、常压电泳仪、电泳槽2、醋酸纤维素薄膜（28cm）3、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板4、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）5、滤纸6、镊子7、试管、试管架、吸量管8、分光光度计,（定量用）,操作步骤,1、薄膜准备 将醋酸纤维素薄膜切成28cm的小条。在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。在薄膜角上用铅笔作一标记。将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。,操作步骤,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置,操作步骤,2、电泳仪准备 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。,操作步骤,3、点样（电泳的关键步骤）用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血浆中沾一下，再在膜条点样线处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血浆样品。点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。,操作步骤,4、上槽 待血浆吸入膜后，以薄膜粗面向下、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。切勿使点样处与电泳槽接触,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,操作步骤,5、电泳 检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电4060min。电压：110130V（10V/cm膜长）薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。电流：0.40.6mA/cm膜宽 有数条膜便求数条膜宽的总和。,操作步骤,6、染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换23次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。,操作步骤,血浆蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱,操作步骤,7、透明 薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。,操作步骤,8、定量（略）洗脱比色法 光密度计扫描法,应 用 实 例,血清蛋白电泳,光密度扫描,同工酶：催化相同化学反应，而蛋白质分子结构不同的一组酶。,乳酸脱氢酶,乳酸脱氢酶同功酶电泳,*生理及临床意义 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。,2,3,4,5,血红蛋白的结构,血红蛋白,地中海贫血：由于和珠蛋白肽链合成异常而导致其比例不均衡引起的溶血性贫血。,正常人Hb区带：从负极向正极泳速最快的HbA，占大部分，约95%；HbA后有一较浅 区带为HbA2，正常人约2-3%,操作流程,1、薄膜准备2、电泳仪准备3、点样4、上槽5、电泳6、染色及漂洗,注意事项,1、最好选用同一批号、厚薄均匀、质量良好的醋纤膜。2、样品要新鲜。3、点样要细窄、均匀、集中。4、盐桥要平整。5、电泳槽盖要密封。6、室温不宜过高。,注意事项,7、选择合适的缓冲液离子强度。8、两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面。9、要控制好电压、电流和电泳时间。10、电泳槽内两极溶液要交替使用，操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变，防止霉菌的滋长。,课后思考,1、简述血红蛋白电泳诊断地中海贫血的原理及检验指标.2、简述肾病综合征、慢性肝炎及肝硬化患者的血浆蛋白电泳结果可能出现怎样的改变.,
