血清蛋白的分离.ppt
血清蛋白的分离,(1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。,目的要求,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成，形成孔径不同的两种胶体。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应。本次试验采用不连续电泳系统PAGE，通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。,聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分，但两者的原理完全相同，只是所用的电泳槽不同。由于时间问题，本次试验将分两组进行，一组使用圆盘，一组使用垂直板。,夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽，电泳仪，直流稳压电源，玻璃板（1313），注射器及微量注射器抽气泵，干燥器，培养皿，玻璃棒，吸量管，烧杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，滤纸，日光灯,实验仪器,制备分离胶、浓缩胶有关试剂：凝胶缓冲液，分离胶贮存液，0.8%过硫酸铵；浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮存液，40%蔗糖溶液，核黄素。Tris-甘氨酸电极缓冲液（PH8.3）已加入溴酚蓝指示剂的血清样品染色液（氨基黑）1%琼脂（糖）溶液脱色液（7%乙酸溶液）由学生自己配制,实验试剂,一、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备：（1）安装夹心式电泳槽 将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧。,实验步骤,（2）分离胶的制备,按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面，（注意加水时，不要引起胶面的大波动）。在室温中放置，当两界面出现不同折射率时表明已凝胶，时间大约40 分钟，以出现折射率不同的界面为准，再室温下放置十分钟，使凝胶充分。将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备。,(3)浓缩胶制备：,按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，3050分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准），凝好后小心拔去加样梳。,将 Tris甘氨酸电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板，长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入约5ul的样品。,2.加样,将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极，接通冷却水，开始电泳。开始时电流控制在10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm 左右时，电泳完成。将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2 次（注意将正负级的缓冲液分开回收）。,3.电泳,4.剥胶 将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块玻璃板轻轻剥开，然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中。5.固定，染色 在培养皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板，染色分钟左右，此时染色与固定同时进行。（染色液要回收利用）6.脱色 用 7%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去。,1.凝胶的制备：（1）安装圆形玻管 将洗净的玻璃管烘 干后用橡胶玻璃头封 严，放置在一边等待 灌胶。,二 圆盘聚丙酰胺凝胶电泳,(2)分离胶制备 按垂直板的方案进行配胶，混匀后迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面，在室温中放置，当两界面出现不同折射率是表明已凝胶，将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备。(3)浓缩胶制备（同垂直板）：按垂直板的方案进行配制，配制好后，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约1cm，然后放于日光灯下10 分钟左右浓缩胶就开始凝胶，3050 分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准）。,2.加样将 电极缓冲液稀释10 倍后倒入电泳装置的上.下槽中（注意需没过玻璃管的上下端），用微量注射器通过缓冲液在每个玻璃管的凝胶表面加约5ul 的样品3.电泳将样品端(上槽)接直流稳压电泳仪的负极，下槽接直压电泳仪的正极。开始时电流控制在1-2mA/管，待样品进入分离胶时，将电流调至5mA 左右/管。当蓝色染料迁移至距离玻璃管下缘1-2cm 左右时，停止电泳。将缓冲液回收至试剂瓶中（注意正负极分开回收）。,4.剥胶将玻璃管从电泳槽中取下，用注射器吸满自来水后将针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，使针头在管壁和胶之间前进，胶条在水的压力及润滑的作用下自玻管中脱出，将其放入培养皿中。5.固定，染色，脱色（同垂直板）,由于与凝胶集合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格地清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。用琼脂（糖）封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。,注意事项,灌胶时，若担心琼脂封底不牢固，则可在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面上面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏。浓缩胶凝胶完全聚合后，必须放置30min左右，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后扭曲（凝胶加“老化”整个过程用时大约50分钟）。电泳时，电泳仪与电泳槽间正负极不能接错，以免样品反方向泳动。,注意事项,电泳后，应分别收集上、下贮槽（正负极）电极缓冲液，切不可混合回收。染色液要及时回收。,注意事项,垂直板电泳结果：,实验结果展示,圆盘电泳结果：,结果展示,实验安排,谢谢大家！祝大家试验成功！,
