荧光显微镜的结构及荧光染色.ppt

荧光显微术,1.了解荧光显微镜的基本构成和基本原理。2.初步掌握荧光显微镜的调节步骤和使用。,实验目的,实验用品,Olympus荧光显微镜，载玻片，盖玻片，擦镜纸，吖啶橙染料等实验用材料。,实验内容,一、荧光显微镜的成像原理二、荧光显微镜的基本结构三、荧光显微镜的使用方法四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光,一、显微镜的成像原理,荧光显微镜是利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。自发荧光:组织、细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈现的荧光，称为自发荧光。继发性荧光:组织、细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的某种成分结合后而呈现的荧光为继发性荧光。,二、荧光显微镜的基本结构和光路图,1.基本结构:光源：超高压汞灯,用以产生强光照(含大量紫外光,蓝紫光)滤片系统:激发滤色镜，提供一定波长范围的激发光.阻断滤色镜,透过相应波长范围的荧光,阻断 或吸收剩余激发光.二向分色镜，透射长波光线和反射短波光线的功能.荧光物镜普通显微镜,荧光显微镜结构图,荧光显微镜的光路图,三 荧光显微镜的使用方法,1.汞灯的安装:切断电源,从插座上拔下电源线.开启灯室,将汞灯安装到灯架上.严防手指触摸灯管,特别是中心球状部分,以免污染 汞灯装入灯室,封上灯室盖后,方可按通电源.,（一）荧光显微镜的调整方法,2.汞灯的点亮:确信各连接部分皆处于正常状态 接通启动器电源开关,按下起动钮,汞灯点亮,经2-3min,电弧趋于稳定.点亮后 15min内,勿切断电源,一旦汞灯熄灭,在5min或稍长时间内,不许重新点亮,待汞灯冷却后,始能再次点亮.,3.汞灯的调中:开启光阀.开放孔径光阑和视场光阑至最大开度,即“Min”-“Max”.旋转物镜转换器,无物镜的空洞进入光路,旋下防尘盖光线射向镜台.载物台上放一白纸,让汞灯电弧像投在其上.用灯室外的聚焦杆,使电弧像在白纸上聚焦，并用调中螺钉,调中汞灯。,4.滤色镜系统的配合使用:该荧光显微镜具激发滤色镜,阻断滤色镜和二向色镜等。,5.样品聚焦:经荧光染料染色的样品放在载物台上,先用溴钨灯透射照明,用低倍物镜聚焦,待寻找到最佳影像后,熄灭溴钨灯改用汞灯.点亮汞灯,嵌入系统滤色镜 使用 UVFL 40X(Oil)和 UVFL 100X(Oil)油浸物镜,应用无荧光浸油,物镜的内装可变光阑应适当缩小,以增大影像反差和清晰度.在UVFL 40X(dry)物镜内装有校正环,对较薄或较厚的盖片进行球面校正.,6.缩小光阑开度 视场光阑(F)和孔径光阑(A)的开度,在观察样品时应朝“Min”向转动,使其适当缩小.7.光阀的使用 在荧光观察暂短中止时,可用光阀阻断光路,勿 熄灭汞灯,以免减短其使用寿命.,（二）荧光镜检样品的制作,1.不能使用本身能产生荧光的药剂2.切片标本不能太厚3.因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。4.最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。5.封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。,材料:藻类,鸭趾草下表皮,动物结缔组 织,血细胞,花粉.染液:0.01%丫啶橙染液.观察藻类，鸭趾草下表面叶绿体的自发荧光丫啶橙染花粉,血细胞,疏松结缔组织。,四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光,1.影响荧光显微镜成像质量的因素2.激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？两者有何关系？怎样选用？,思考题,