自学内容1基因工程基本操作.ppt

第六章基因工程的主要操作原理,2011-9-24,基因工程基本操作,2,第一节 DNA提取,（一）总DNA的提取大肠杆菌总DNA提取植物总DNA提取动物总DNA提取质粒DNA提取噬菌体DNA提取,2011-9-24,基因工程基本操作,3,DNA的应用：构建基因组文库：100kbSouthern杂交(包括RFLP)：50kbPCR分离基因等：50kb,2011-9-24,基因工程基本操作,4,因“材”施提根据不同研究需要，保证结构的相应完整性尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子,在DNA提取过程中应做到,2011-9-24,基因工程基本操作,5,1.大肠杆菌总DNA提取,机械裂解化学裂解：溶菌酶 or EDTA or both,SDS,去蛋白：酚/氯仿抽提浓缩：乙醇，加单价阳离子，如Na+储存：-20放置,2011-9-24,基因工程基本操作,6,2011-9-24,基因工程基本操作,7,操作步骤,100 mL 细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。加9.5 mL TE悬浮沉淀,并加0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K,混匀,37保温1小时。加1.5 mL 5mol/L NaCl,混匀。加1.5 mL CTAB/NaCl溶液,混匀,65保温20分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1ml TE,-20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。,2011-9-24,基因工程基本操作,8,2.植物细胞总DNA提取,总原则：取材液氮研磨裂解去蛋白和细胞物浓缩,2011-9-24,基因工程基本操作,9,（1）CTAB法,CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)(十六烷基三乙基溴化铵)一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到0.3 mol/L NaCl时，从溶液中沉淀。,高盐提取-低盐沉淀-高盐溶解-乙醇沉淀,2011-9-24,基因工程基本操作,10,经典的CTAB法使用两种缓冲液 高盐提取缓冲液：1（冷冻干燥材料）或2CTAB（新鲜材料）、0.7 mol/L或1.4 mol/L NaCl沉淀缓冲液：1CTAB，不含Nacl,CTAB法的优点能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可优先使用在提取前能同时得到高质量的DNA及RNA。可根据需要分别进行纯化，如只需要DNA，则可用RNase（核糖核酸酶）水解掉RNA。,2011-9-24,基因工程基本操作,11,(2)SDS法,利用高浓度的SDS，在较高温度(5565)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5molL的KAc于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,2011-9-24,基因工程基本操作,12,SDS 法的优缺点优点：SDS法操作简单、温和，也可提取到分子量较高的DNA。缺点：产物含糖类杂质较多。该方法所得的DNA样品也可直接用于Southern杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。,2011-9-24,基因工程基本操作,13,3.动物细胞总DNA提取,取材液氮研磨裂解：SDS和蛋白酶K去蛋白和细胞物浓缩,2011-9-24,基因工程基本操作,14,操作步骤,切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。加1 mL 10%SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。加50 l或1mg 蛋白酶 K,37保温1-2小时,直到组织完全解体。加1 mL 5 mol/L NaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。,2011-9-24,基因工程基本操作,15,取上清加1/10 体积3 mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000 rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5 l RNaseA(10 g/l),37保温30分钟,用酚抽提后,按步骤8-9重沉淀DNA。,2011-9-24,基因工程基本操作,16,（二）质粒DNA提取,如何区分细菌染色体DNA和质粒DNA?二者的分子构型不同。大肠杆菌染色体DNA构型：线性的或开环的DNA分子 质粒：共价闭合环状的DNA(cccDNA)分子,2011-9-24,基因工程基本操作,17,1.碱法提取质粒的原理,当溶液的pH值在12.012.5时，线性的DNA会被变性，两条链彻底分开；而对于cccDNA，虽然氢键会断裂，但互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。中性pH值是cccDNA迅速地复性；而线性的染色体DNA不能复性,聚集形成网状结构。离心:留在上清液中的是cccDNA，沉淀中是线性DNA和细胞残骸蛋白,2011-9-24,基因工程基本操作,18,提取的主要步骤,细菌的培养,细菌的收集和裂解,质粒DNA的分离和纯化,2011-9-24,基因工程基本操作,19,试剂,溶液:50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。溶液：0.2N NaOH，1%SDS。溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。TE buffer：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）乙醇（无水乙醇、70%乙醇）,2011-9-24,基因工程基本操作,20,操作步骤,挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0 mL LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250 g振荡培养过夜（约12-14 hr）。取1.5 mL培养物入微量离心管中，室温离心8000 g1 min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。将细菌沉淀重悬于100 L预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。加200 L新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀并将离心管放置于冰上2-3 min，使细胞膜裂解。,2011-9-24,基因工程基本操作,21,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质。离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白质。乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA。用无DNase的RNase去除残余的RNA,2011-9-24,基因工程基本操作,22,（三）噬菌体DNA提取,溶源性噬菌体：诱导裂解参考第三章,接种量是诱导裂解的关键细胞密度低：接种后所有细胞很快裂解细胞密度高：持续感染，没有裂解接种密度合适：细胞可以持续生长一段时间，并且最终全部被裂解从而释放子代噬菌体。,第二节 RNA的提取,2011-9-24,基因工程基本操作,24,防止RNA降解,抑制RNase活性,所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能污染样品。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中，200烘烤2小时以上。材料如塑料容器等皆需用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,高压灭菌。,2011-9-24,基因工程基本操作,25,DEPC使用方法,DEPC是RNase的化学修饰剂,它和RNase的活性基团（组氨酸的咪唑环）反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制.,2011-9-24,基因工程基本操作,26,无RNase灭菌水：用经高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。,2011-9-24,基因工程基本操作,27,提取方法,异硫氰酸胍热苯酚法Trizol 法mRNA纯化：3末端ploy(A)tail,2011-9-24,基因工程基本操作,28,（一）动植物总RNA提取Trizol法,适用范围:人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，(mgg)优点：无蛋白和DNA污染用途：Northern斑点杂交Poly(A)-mRNA分离体外翻译RNase封阻分析,2011-9-24,基因工程基本操作,29,组织液氮研磨加Trizol（1mL Trizol/50-100 mg材料）,室温放置5分钟，,0.2 mL氯仿/1mL Trizol,离心取上清,2011-9-24,基因工程基本操作,30,0.5 mL 异丙醇/mL Trizol,室温放置10 min，离心取沉淀,75%乙醇洗沉淀，干燥,2011-9-24,基因工程基本操作,31,（二）mRNA纯化,原理：mRNA 3末端-poly(A)+oligo(dT)纤维素-oligd(T)高盐缓冲液，mRNA特异的吸附低盐浓度或蒸馏水中，mRNA洗脱两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA,2011-9-24,基因工程基本操作,32,（三）植物病毒RNA提取,取提纯的病毒颗粒TMV等体积酚/氯仿抽提取上清等体积酚/氯仿抽提取上清等体积氯仿抽提乙醇沉淀,第三节核酸电泳,2011-9-24,基因工程基本操作,34,1.基本原理DNA或者RNA中磷酸基团是呈离子态的，可以说DNA和RNA的多核苷酸链可以叫做多聚阴离子，在电场下会向正极移动。,2011-9-24,基因工程基本操作,35,2.迁移速率的决定因素,DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同DNA分子的构象 超螺旋DNA移动环状线状双链DNA,2011-9-24,基因工程基本操作,36,电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大。电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小 电压不得超过5v/cm。嵌入染料的存在 EB嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15。,2011-9-24,基因工程基本操作,37,离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。,2011-9-24,基因工程基本操作,38,3.电泳缓冲液,TAE：含EDTA(pH8.0)、Tris-乙酸TBE：Tris-硼酸、EDTATPE：Tris-磷酸、EDTA一般配制成浓缩母液，储于室温。,2011-9-24,基因工程基本操作,39,4.琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种线性多聚化合物，从红色海藻产物琼脂中提取出来的。胶的分辨能力与浓度有关。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。,不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围,2011-9-24,基因工程基本操作,41,低熔点琼脂糖（LMP）用于分离纯化DNA片段EB的染色原理 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光。,2011-9-24,基因工程基本操作,42,2011-9-24,基因工程基本操作,43,5.脉冲电场凝胶电泳,pulsed-field gel electrophoresis，PFGE作用 分离超大分子量的DNA分子，如整条染色体（长达到107 bp的DNA分子）。原理（1）在脉冲电泳中，加在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间在交替的改变，DNA迁移方向随之改变。（2）大分子量DNA的调整要比小分子量DNA的调整需要更多的次数来更换其构型和方位，因此它的迁移率就会慢一些。,c,2011-9-24,基因工程基本操作,44,思考题,碱法提取质粒的原理影响DNA迁移率的因素有哪些脉冲电场凝胶电泳原理,