肿瘤免疫治疗-肿瘤生物治疗学基础知识.ppt

肿瘤免疫治疗-肿瘤生物治疗学基础知识,福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院叶韵斌,目的与要求：肿瘤免疫学是研究肿瘤发生、发展与机体免疫系统之间的关系，以及应用免疫学原理和手段对肿瘤进行预防、诊断和治疗的一门学科。通过本课程的学习，全面了解机体的抗肿瘤免疫监视机制，包括特异性和非特异性的免疫机制；肿瘤的免疫逃逸机制；免疫编辑假说。深入认识肿瘤与免疫系统相互作用机制，了解肿瘤的生物学特性，以及肿瘤免疫治疗在肿瘤综合治疗中的地位和作用。,第一章、肿瘤免疫学概述,肿瘤免疫学（Tumor immunology）是研究肿瘤抗原、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展和转归的相互关系；机体对肿瘤的免疫应答以及肿瘤细胞逃逸免疫效应的机制；肿瘤免疫学诊断；以及免疫学预防和治疗的学科。,第二章、免疫系统的基本组成和功能,免疫细胞 细胞因子主要组织相容性复合体、粘附分子 免疫耐受 抗肿瘤免疫应答过程 机体对肿瘤抗原的免疫应答,免疫系统是机体识别自我和非我，引发免疫应答、执行免疫效应和最终维持自身免疫稳态的组织系统免疫器官：中枢免疫器官胸腺、骨髓 外周免疫器官淋巴结、脾脏免疫细胞：主要是指能识别抗原，产生特异性免疫应答的 淋巴细胞等各种细胞。细胞因子：机体的免疫细胞和非免疫细胞能合成和分泌小分 子的多肽类因子，它们调节多种细胞生理功能，这些因子统称为细胞因子（cytokines）。主要组织相容性复合体：肿瘤抗原递呈抗肿瘤免疫应答：细胞免疫、体液免疫免疫耐受：是指免疫活性细胞接触抗原性物质时所表现的无应答状态（a state of specific unresponsiveness）,一、免疫细胞,（一）T淋巴细胞-主要的抗肿瘤效应细胞 表面标志：CD3 CD8+抗肿瘤作用：A.结合肿瘤抗原，杀伤肿瘤细胞 B.分泌细胞因子CD4+抗肿瘤作用：A.辅助激活CTL,B细胞,NK，巨噬细胞;B.分泌细胞因子：IL-2，IFN-，TFN-C.少数属于细胞毒性T细胞具有杀瘤作用,（二）B淋巴细胞-表面标志：CD19 介导体液免疫应答（三）NK细胞-表面标志：CD16CD56 1）非特异性杀伤2）无MHC限制性，无需预先致敏3）不依赖抗体和补体4）ADCC5）释放IFN-,（四）树突细胞-表面标志：CD1a、CD80、CD40、CD86.是目前公认的功能最强的抗原递呈细胞，高表达MHCI类和MHCII类分子功能：DC携带抗原通过MHC限制性途径把抗原递呈给T细胞，激活T细胞而激发免疫应答,（五）巨噬细胞-表面标志：CD68 1）处理和呈递抗原 2）活化的巨噬细胞通过溶酶体酶直接杀伤 3）可通过分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细胞 4）合成和释放NO 5）ADCC,二、细胞因子,（一）细胞因子的定义 细胞因子（cytokines,CKs）是一类由活化的免疫细胞和非免疫细胞（如成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞及某些肿瘤细胞）所分泌的小分子蛋白质的统称，能够作用于分泌细胞本身或邻近其他细胞，具有调节免疫效应、炎症反应等多种生物学活性。,（二）研究的历史 细胞因子的研究渊源始于50年代的干扰素研究和60年代的集落刺激因子研究。基因工程技术的迅速发展，带来了细胞因子研究的突破性进展。80-90年代相继克隆出一大批细胞因子，细胞因子的化学本质是多肽，从信息传递的角度，细胞因子是生物体内一类重要的第一信使分子，是细胞内基因表达的产物。,（三）细胞因子的种类按作用分：调节天然免疫的细胞因子：TNF-a、IL-1、IL-6等调节获得性免疫的细胞因子：IL-2、IL-4、IFN-等作用于造血系统的细胞因子：CSF、IL-3、IL-7等按细胞来源分类：免疫细胞产生的细胞因子：IL-2、IL-3、IL-4等非免疫细胞产生的细胞因子：IL-7、IL-8、IL-11、CSF等,细胞因子的作用方式：自分泌作用 旁分泌作用 内分泌作用。细胞因子的作用特点：多效性 重叠性 协同性 拮抗性 双重性,研究意义,细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。,三、主要组织相容性复合体、粘附分子,（一）主要组织相容性复合体 同种异体移植物移植后会发生免疫排斥反应，这是由细胞表面的同种异型抗原诱导的，这种抗原称为组织相容性抗原。体内具有多种组织相容性抗原，其中能引起强而迅速的排斥反应者称为主要组织相容性抗原，其编码的基因是一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体,人的MHCHLA复合体（6#染色体）,1.经典的HLA I类、HLA II类基因,HLA I类基因（HLA Ia）：HLA-A(locus)HLA-B HLA-CHLA II类基因：HLA-DP(subrigon)HLA-DQ(locus A B)HLA-DR,2.免疫功能相关基因,（1）补体gene（III类基因）（2）抗原加工、递呈相关gene（II类基因）LMP、TAP、HLA-DMHLA-DO、TAP相关蛋白gene,（3）非经典的HLA I类gene（HLA Ib）HLA-E、HLA-G、HLA-F（4）炎症相关geneTNF gene转录调节因子MIC（MHC I 相关 gene）：MICA、MICBHSP,（二）粘附分子定义：是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白作用：参与调节免疫细胞的凋亡 参与免疫应答和免疫调节 参与免疫细胞的发育和分化,B7分子：主要分布于B细胞、DC细胞、激活 的单核细胞和T细胞 CD28-激活T细胞 配体 CTLA-4-抑制T细胞活化,细胞粘附因子-intracellular adhesion molecule ICAM ICAM-1（CD54）ICAM-2（CD102）ICAM-3（CD50）作用：介导免疫免疫细胞的活化、免疫细胞之间及免疫细胞与其他细胞的接触、免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤,(三)抗原递呈MHC-I类分子呈递途径：参与内源性抗原的呈递过程 MHC-II类分子呈递途径：参与外源性抗原的呈递过程抗原的交叉呈递：MHCI类分子也能递呈外源性抗原，MHCII类分子也能递呈内源性抗原。,HLA,基本概念,抗原加工：蛋白质抗原在细胞内被降解成能与MHC分子结合的肽的过程。抗原递呈：MHC分子与抗原肽结合，将其展示于细胞表面供T细胞识别的过程。内源性抗原：细胞内产生的蛋白质抗原，包括自身抗原和非己抗原-MHC分子递呈。外源性抗原：由细胞外摄入细胞内的蛋白质抗原，包括非己抗原和自身抗原-MHC分子递呈。,Antigens must be processed in orderto be recognised by T cells,T cellresponse,无应答,无应答,无应答,无应答,抗原加工、递呈,抗原递呈细胞 能摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给淋巴细胞的细胞，又称为辅佐细胞。,专职APC(professional APC)能组成性表达MHC-II类分子、具有较强的抗原提呈作用，包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞等。,兼职APC 非组成性地表达MHC-II类分子，抗原提呈能力弱，包括内皮细胞、纤维母细胞、上皮及间质细胞等。肿瘤细胞、病毒感染细胞等也可通过MHC-I类分子途径提呈抗原。此类CTL的靶细胞属广义APC。,抗原加工递呈的意义,实现免疫系统对非己抗原的免疫监视作用免疫调节作用,四、免疫耐受,（一）定义：免疫耐受（immune tolerancnce）指抗原诱导特异性淋巴细胞失活或死亡，导致机体不能对该抗原产生应答的现象。,（二）T细胞免疫耐受中枢性免疫耐受：T细胞的阴性选择 T细胞的否定现象外周性免疫耐受：生理性屏障对自身抗 原的不识别 外周血自身反应性T 细胞克隆的清除 缺乏激活信号 具有潜在自身反应性 的T细胞被抑制,（二）B细胞免疫耐受中枢性免疫耐受：克隆排除 克隆无能(clonal anergy)外周性免疫耐受：已活化的细胞受到大量 抗原持续刺激时，可被 诱发凋亡。,研究免疫耐受的意义及应用,1.理论方面的意义2.临床治疗方面的意义和应用治疗自身免疫病防止器官移植后的排斥反应肿瘤治疗,五、抗肿瘤免疫应答 机体抗肿瘤的免疫学效应机制,（一）细胞免疫机制 细胞免疫在机体抗肿瘤效应中起重要作用。1、CD4+T细胞：参与B细胞、巨噬细胞、NK细胞 和CTL细胞的活化和抗肿瘤效应。A.辅助激活CTL,B细胞,NK，巨噬细胞;B.分泌细胞因子：IL-2，IFN-，TNF-C.少数属于细胞毒性T细胞，具有杀瘤作用,2、CD8+T细胞：在机体抵抗肿瘤效应中起关键作用。CTL（细胞毒性T淋巴细胞）A.通过其细胞膜上的T细胞抗原识别受体（TCR），特异性识别MHC分子肿瘤抗原肽复合物，引起T细胞活化、增殖，杀伤肿瘤细胞。B.分泌细胞因子,3、抗原递呈细胞：M、DC A.通过摄取、加工处理和递呈肿瘤抗原，激发特异性T细胞免疫而发挥抗肿瘤效应。B.活化的巨噬细胞通过溶酶体酶直接杀伤,且可通过分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细 胞。C.合成和释放NO D.ADCC,4.NK细胞非特异性免疫应答 A.非特异性杀伤B.无MHC限制性，无需预先致敏C.不依赖抗体和补体D.ADCCE.释放IFN-,（二）体液免疫机制1、激活补体系统溶解肿瘤细胞2、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）3、抗体的免疫调理作用4、抗体封闭肿瘤细胞上的某些受体作用5、抗体使肿瘤细胞上的黏附特性改变或丧失作 用,Ag,IL-12,活化DC,Th1,DC,CTL,CD4,CD4,IL-12,NK/NKT,Tumor,IFN,IL-2IFN,IL-12,抗肿瘤免疫应答,六、机体对肿瘤抗原的免疫应答,认识肿瘤抗原以及肿瘤抗原在免疫应答中的作用,肿瘤抗原,细胞恶性变过程中出现的新抗原(neoantigen)及过度表达的抗原物质的总称。包括突变的癌基因和抗癌基因编码的蛋白、病毒诱导的肿瘤细胞表面常常表达病毒基因编码的蛋白、共同肿瘤抗原、胚胎抗原。,肿瘤抗原的分类,根据特异性分类1）肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)肿瘤细胞所特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。2）肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA）非肿瘤细胞所特有、正常细胞和其它组织上也存在的抗原，细胞癌变时，含量增加。,机体对肿瘤抗原的免疫应答,机体抗肿瘤的免疫学效应机制十分复杂，涉及多种免疫成分，包括先天性免疫（非肿瘤特异性免疫）和获得性免疫（肿瘤特异性免疫），二者共同参与机体免疫机体免疫。对于免疫原性较强的肿瘤，特异性免疫应答起主要作用对于免疫原性较弱的肿瘤，非特异性免疫应答更重要,第三章、免疫调节机制,免疫调节-指抗原驱动的免疫应答过程中，通过免疫细胞之间，免疫细胞与免疫分子之间及免疫系统与其他系统之间的相互作用，使免疫应答维持在适当的强度和时限以保证机体免疫功能的稳定的生物学过程。免疫细胞调节：调节型T细胞 NK T细胞 T细胞 巨噬细胞,调节型T细胞（regulatory T cells,Treg）,促进一些抑制性细胞因子的分泌、下调免疫共刺激分子和粘附分子的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制自身反应性T细胞的免疫反应以及抑制传统T细胞的活化等。其免疫抑制机制尚不十分清楚,NK T细胞,是一类特殊的T细胞亚群，既表达T细胞受体，同时又能表达NK的表明标记CD161,T细胞,在抗微生物感染免疫和抗肿瘤免疫中发挥重要作用,巨噬细胞,抗肿瘤的作用机制抗肿瘤功能的抑制及促肿瘤生长的机制,肿瘤对机体免疫功能的影响,肿瘤诱导的抑制性细胞 Ts 抑制性巨噬细胞肿瘤诱导的体液抑制因子 封闭抗体 肿瘤细胞产物的免疫抑制作用 TGF-，IL-10,第四章、肿瘤免疫逃逸机制,抗原缺失和调变 肿瘤细胞MHC I分子表达低下肿瘤细胞表面抗原被封闭肿瘤细胞缺乏协同刺激信号肿瘤细胞的“漏逸”免疫抑制作用肿瘤抗原诱发免疫耐受肿瘤细胞抗凋亡或诱导免疫细胞凋亡,肿瘤细胞“漏逸”,某些突变可以是肿瘤细胞迅速生长从而超过了机体的抗肿瘤免疫效应，导致宿主不能有效地清除大量生长地肿瘤细胞，称为肿瘤细胞地“漏逸”,肿瘤细胞的免疫原性降低,肿瘤细胞异常的HLA表型 A。正常细胞HLA I类分子表型(举例)。肿瘤细胞异常HLA I类分子表型；B。全部丢失，包括HLA-A、HIA-B、HLA-C；C。HLA一条单元型丢失，即HLA-A、HLA-B、HLA-C三位点均丢失一半等位基因；D。某一位点丢失(此处为HLA-B或A位点)；E。某一等位基因丢失(此处为HLA-B44)。,肿瘤表达免疫抑制分子和诱导淋巴细胞凋亡,肿瘤的免疫豁免,肿瘤诱发免疫抑制,1、肿瘤诱导免疫抑制细胞抑制性T细胞抑制性NKT细胞抑制性巨噬细胞,2、肿瘤诱导免疫抑制因子转化生长因子白细胞介素-10前列腺素,3、肿瘤诱导T细胞成分和功能紊乱T细胞亚群紊乱Th1/Th2漂移T细胞信号通路异常,肿瘤血管内皮细胞与免疫逃逸,肿瘤血管内皮细胞表面各种细胞粘附分子地表达水平降低肿瘤血管内皮细胞MHC类分子的表达异常肿瘤血管内皮细胞的抗自由基损伤活性增强肿瘤血管内皮细胞合成细胞外基质能力增强,第五章、肿瘤免疫学理论的演变,免疫监视学说,Burnet提出免疫监视学说：机体在生长发育的过程中，其体细胞会时常发生突变，有些突变可能会导致细胞恶化转化。当具有异常增殖能力的肿瘤细胞在体内形成时，它们携带新的抗原决定簇，随着肿瘤细胞的增殖，当新的抗原达到一定数量时，就开始产生胸腺依赖性免疫反应，最终排斥肿瘤。,人类的免疫监视现象,免疫缺陷或免疫抑制的个体具有更高的肿瘤发生率。对移植后应用免疫抑制剂的患者和先天性免疫缺陷患者的追踪观察结果显示其肿瘤发生的相对危险度明显增高。,肿瘤免疫编辑,此假说认为，免疫系统既可能清除肿瘤细胞或对肿瘤细胞产生非保护性免疫反应，又可能促进免疫无反应性或免疫耐受性的产生。肿瘤细胞在于免疫系统的相互作用过程终，免疫原性强的克隆被清除，免疫原性弱的克隆被保留，肿瘤细胞基因组的不稳定性导致免疫原性更弱的克隆最终形成优势肿瘤细胞群体。3个过程：免疫清除；免疫平衡；免疫逃逸,第六章、肿瘤的免疫治疗,基本原理：提高肿瘤抗原免疫原性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，提高肿瘤对抗瘤免疫效应的敏感性，在体内外诱生肿瘤特异性效应细胞和分子等。抗肿瘤免疫治疗包括主动免疫治疗、被动免疫治疗。,一、细胞因子治疗,1、干扰素1）I型干扰素：由单核巨噬细胞、病毒诱导的成纤维细胞、转化的B细胞产生 种类：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-等 作用：抑制肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡 调节免疫反应 感染肿瘤血管生成 其它作用：抗病毒2）II型干扰素：由活化的T细胞、原始的Th0细胞和NK细胞产生 种类：IFN-作用:激活巨噬细胞、NK细胞等直接杀伤癌细胞 延长细胞周期、抑制肿瘤细胞的生长和增殖 促进MHC-I、II类分子和抗原递呈细胞尚共刺激分子的表达 在干扰素的调节下，IFN-可诱导Th0向Th1分化，抑制向Th2分化，增强细胞免疫和CTL的杀伤活性临床药物：基因工程产品，已国产化。干扰灵、赛若金、因特芬、派罗欣。,适应症：干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾癌、黑色素瘤、kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤，其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌和膀胱癌等。对慢性乙、丙型肝炎也有效。用法：第1周300万单位，皮下注射，每周23次，第2周每次加到500600万单位，第3周加到9001000万单位连续6周，共8周为1疗程。干扰素亦可局部注射（瘤周浸润）、腔内注射（癌性胸腹腔积液）或膀胱内灌注。,毒副作用：高剂量干扰素具有一般生物制剂的反应即发热、流感样症状，肌肉酸痛等，其次是轻度骨髓抑制。一般对肝肾功能无影响，少数有转氨酶、血肌酐升高。,2、白细胞介素-2（IL-2)来源：主要由激活的T淋巴细胞分泌和表达，此外NK、转化的B细胞和LAK细胞也可产生 作用：促进T细胞增殖及相应的细胞因子分泌 刺激NK生长并增强其杀细胞活性 诱导LAK、NK、TIL扩增及细胞因子的分泌 促进B细胞分化、增殖和产生抗体 参与机体的炎症反应、抗肿瘤免疫反应和移植排斥反应临床药物：基因工程IL-2 欣吉尔、德路生、远策欣。,适应症：用于肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直肠癌、淋巴瘤、肺癌等恶性肿瘤的治疗。用于癌性胸腹水的控制。用于手术后、放疗及化疗后的肿瘤治疗，可增强机体免疫功能。也用于自身免疫性疾病和病毒性、细菌性疾病的治疗，如乙肝、结核病。用法：1）胸腹腔注射 100-200万IU/次，每周1-2次，2-4周为一疗程。2）局部注射 根据癌灶大小决定剂量，每次每个病灶不少于610万IU，隔日1次，4周为一疗程。3）皮下注射 60-100万IU/m3，每日1次，每周5次，4周为一疗程。4）静脉滴注 40-80万IUIU/m3，每日1次，缓慢滴注，每周5次，4周为一疗程。,毒副作用：治疗中常见副反应为发热、寒战、乏力、恶心、轻度食欲下降等。其他少见的副反应包括局部反应、皮疹、血压下降、水潴留、转氨酶升高等。这些副反应多为轻度、易耐受，停药后可自行缓解。必要时可给与消炎痛或给予升压等措施对症处理。,3、IL12：主要是由抗原呈递细胞（如单核巨噬细胞、树突细胞及B淋巴细胞产生）作用：诱导Th0分化为Th1，增强细胞免疫应答 促进NK、T细胞增殖，诱导LAK、TIL产生，并增强上述细胞的杀伤功能 诱导Th1、NK分泌IFN-促进巨噬细胞分泌一氧化氮，杀伤肿瘤细胞 抑制肿瘤血管的生成 增强肿瘤细胞表达MHC-I II类分子，提高肿 瘤细胞对免疫效应细胞的易感性 增加抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈功能,动物试验：应用基因工程技术，将IL-12基因导入肿瘤细胞、树突细胞、成纤维细胞等，制成肿瘤疫苗，使IL-12在局部分泌，诱发机体的抗肿瘤免疫。,临床试验：最近的一个多中心、随机的临床试验，重组人(rHu)IL-12分别以003g、025g或05gkg 2周x 12周，治疗46例慢性乙型肝炎病人。与治疗前比较，治疗结束和随访12周后HBV DNA水平显著降低(P0001)。对IL-12的效应与剂量相关，治疗结束时病毒清除3个剂量组依次为 7、13和25；随访结束时5例HBeAg阴转。较大剂量较易有不良反应，包括淋巴细胞和嗜中性细胞数中度减少，3例未完成疗程；注射处可有局部反应；仅1例检出对rHulL-12的抗体。,Ohe等对IL-12治疗癌患者的临床病例作了回顾性的总结报道：IL-12治疗临床上可观察到IL-10产生和NK细胞、LAK活性短暂增高，少数患者能取得部分疗效，但显著性疗效的病例尚未见报道，而且有许多毒副作用，如发热、疲劳、流感样反应、关节痛、肌痛、白细胞减少、肝功能损害等。尽管如此，IL-12治疗前景不可低估。临床证实，IL-12能恢复由实体瘤转移患者PBMC获得的NK细胞活性，IL12还能增强毛细胞白血病患者NK细胞活性。随着对IL-12抗肿瘤机制研究的深入及IL-12用药剂量、途径、协同用药等方面的改进，IL-12将会成功发展为有重要临床应用价值的抗癌新药。,4、IL-4：主要由活化的T淋巴细胞（特别是Th2细胞）产生。作用：促进休止期的B细胞活化，促进B细胞分泌 IgE，增加B细胞的抗原递呈功能，促进体液免疫应 答。维持胸腺细胞和活化T细胞的生长，诱导Th2产生，抑 制Th1分泌细胞因子。诱导NK细胞增殖。激活巨噬细胞，促进其抗原递呈和杀伤肿瘤细胞的作 用。诱导外周血单个核细胞分泌M-CSF和G-CSF，增强中 性粒细胞介导的吞噬、杀伤功能和抗体依赖性细胞介 导的细胞毒效应（ADCC）应用：主要用于DC细胞的诱导、扩增。,5、肿瘤坏死因子TNF 1）TNF-：主要来源于LPS、细菌DNA等抗原分子激活的单核巨噬细胞、其它细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞等产生的。作用：影响免疫反应过程 影响非免疫细胞 促进细胞因子分泌 调控细胞凋亡 全身反应 2）TNF-：主要由Th1、CD8T细胞和早期的B细胞产生作用：是炎症过程的重要组成成分,6、集落刺激因子：是一种低分子量糖蛋白，能够在体内外选择性刺激造血干细胞增生、分化成某一谱系的细胞分类：G-CSF,M-CSF,GM-CSF,IL-3,EPO,SCF,7、胸腺素 分为两族 作用：1）具有免疫增强作用，可促进T细胞、NK、LAK等细胞的增殖及杀伤活性 2）参与细胞骨架的形成，通过对肌动蛋白的调节，参与某些肿瘤的转移,二、肿瘤的主动免疫治疗,应用肿瘤抗原或模拟肿瘤抗原的疫苗刺激机体免疫系统，激发或增强机体的抗肿瘤特异性免疫应答，阻止肿瘤生长、扩散和复发。,肿瘤疫苗,肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不同，它主要不是用于肿瘤的预防，而是通过瘤苗的接种来刺激机体对肿瘤的免疫应答来治疗肿瘤。该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体产生免疫反应。对手术后清除微小转移瘤灶和隐匿瘤、预防肿瘤转移和复发有较好的效果。,1、肿瘤细胞疫苗,即通过自体肿瘤细胞粗提取物，经物理化学或生物手段处理后抑制其生长能力，保持其免疫原性，但其免疫原性好，需加入佐剂如卡介苗等以增强免疫原性，但效果不甚理想。,2、肿瘤基因工程疫苗,肿瘤基因工程疫苗通过基因重组技术，将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗。,1)、提高机体抗肿瘤能力,将外源基因导入免疫细胞，其表达产物作用于免疫细胞，促进免疫细胞生长、分化，从而提高机体的抗肿瘤能力。目前研究较多的是细胞因子基因的转导，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-以及GM-CSF等。实验显示，在各种细胞因子中，以GMCSF基因修 饰的肿瘤细胞疫苗效果最好，这与其诱导DC成熟有关。,2)、增强肿瘤免疫原性,通过表达肿瘤所缺乏的某些分子，以增强其免疫原性。如将B7基因导入具有肿瘤抗原的肿瘤细胞，不仅能恢复肿瘤特异性免疫反应，也可增强IL-2的抗瘤活性。一些肿瘤相关抗原（TAA）基因的转导研究，显示也可以增强其免疫原性，如CEA、AFP、gp100、MART-1。,3)、基因产物直接杀伤瘤细胞,如TNF基因导入肿瘤细胞可使局部持续分泌TNF、从而直接杀伤肿瘤细胞。,3、肽疫苗,肽疫苗主要包括以下二种：1）、癌基因、抑癌基因突变肽疫苗 目前已合成的p21-K-Ras-125突变肽、EGFRvIII突变肽和Her2/neu肽等。2）、病毒相关疫苗 如EB病毒与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤，HBV与肝癌，人类T细胞白血病病毒与成人T细胞白血病。,4、核酸疫苗,核酸疫苗是由能引起保护性免疫反应的抗原基因片段及其载体构建而成。包括DNA疫苗和RNA疫苗。,5、抗独特型抗体疫苗,抗独特型抗体疫苗具有模拟抗原及免疫调节的双重作用，能克服机体免疫抑制，打破免疫耐受，故能代替肿瘤抗原诱导特异性主动免疫反应。肿瘤抗原可诱导抗体(Ab1)产生，该抗体可变区的独特型决定簇具有免疫源性，可诱导抗体Ab2产生，称为抗独特性抗体。在这些Ab2中，有的可模拟原来的抗原结构诱导抗原的特异性免疫反应，可作为 肿瘤疫苗应用。,有些已进入、期临床：卵巢癌相关抗原CA125的独特型疫苗：AcA125黑色素瘤的独特性疫苗：BEC2、TriGem等淋巴瘤的独特性疫苗：Id-KLH乳腺癌的独特性疫苗：1E10结直肠癌的独特性疫苗：105AD7,6、树突状细胞（DC）疫苗,肿瘤抗原属于内源性抗原，机体主要依靠CTL免疫应答杀伤肿瘤细胞。但肿瘤细胞表面的MHC-抗原肽段复合物表达水平低，需要经体内抗原提呈细胞加工、处理，提供诱导T细胞活化的第二信号，才能激发肿瘤特异性CTL的产生。由于DC在诱导体液免疫应答和细胞免疫应答中的重要功能，目前认为，DC在启动抗肿瘤免疫的抗原呈递中发挥重要作用。,Dendritic cells connect innate immunity and adaptive immunity,体外实验证实，人DC至少有三条来自于不同前体细胞的发育途径：1）CD34+细胞分化为DC2）外周血单核细胞分化为DC3）淋巴样DC前体细胞分化途径,临床应用,肿瘤抗原可以基因、多肽、蛋白、甚至完整细胞的形式负荷给DC，因此DC疫苗的制备明显比基因修饰的肿瘤细胞疫苗容易，因而促进了DC疫苗进入临床试验。1996美国斯 坦福大学的Hsu等首先采用抗独特型抗体负荷的DC疫苗治疗了4例B细胞型淋巴瘤，3例获部分缓解。,临床应用,Nestle(1998)等采用肿瘤细胞溶解物或MHCII类分子限制的多肽抗原负荷DC，然后与免疫佐剂KLH（keyhole Limpet hemocyanin）联合应用治疗了16例转移性黑色素瘤，其中2例获完全 缓解，3例获部分缓解，1例获微小反应；在反应的5例患者中，有2例为肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗。,由于大多数肿瘤抗原 未被识别，因此肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗可使更多的患者接受此种方法治疗。,三、肿瘤的被动免疫治疗,（一）、抗体靶向治疗 1.抗肿瘤单克隆抗体直接体内应用 很多进入临床治疗试验，包括抗白细胞 分化抗原CD19、CD20、CD22、CD33，表皮生长因子受体（EGFR），MU C1，前列腺特异性抗原（PSA），前列腺特异性膜抗原（PSMA），癌基因cerbB2产物，神经节苷酯GD3、GM2等抗原的单抗。,2.抗肿瘤单克隆抗体与抗肿瘤药物、生物毒素、细胞因子或放射性核素偶联：生物毒素，如假单胞菌毒素或蓖麻毒素 放射线同位素，如131I、186Re、177Lu、90Y、212Bi、67Cu、等 单抗作为导向物可增加毒素、放射性同位素等在肿瘤局部 的浓度，增加对肿瘤的杀伤力或诱导肿瘤局部的免疫反应。,3.基因工程抗体-毒素（或酶）融合蛋白直接杀瘤 4.抗肿瘤单克隆抗体和抗效应细胞表面分子的抗体组成双特异性抗体，可引导杀瘤效应细胞向肿瘤灶集中 5.胞内抗体在肿瘤细胞内表达，特异性作用于致瘤的癌基因产物或端粒酶,（二）、肿瘤过继性免疫治疗 向肿瘤患者体内输注具有抗瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫效应。回输的效应细胞包括：在体外用肿瘤抗原或淋巴因子激活的淋巴细胞（CIK、TIL等）、导入外援细胞因子基因并表达相应产物的淋巴细胞等。,1、LAK细胞,LAK细胞是在1980年由美国国立癌症研究所Rosenberg发现，并在1982年由Grimm等命名的。这是一类由IL-2激活的能够杀伤NK抵抗的新型免疫细胞，是一种强烈的，广谱的，具有杀瘤活性的细胞。随后临床上广泛应用于肿瘤等疾病治疗。但由于LAK细胞活性的维持需要IL-2，而IL-2副作用大，而且在以后的临床总结中发现LAK细胞疗效较低，现已基本不用。,2、CD3AK细胞,是在LAK细胞基础上，用抗CD3单抗和IL-2联合诱导的杀瘤细胞。由于使用了抗CD3单抗刺激，减少了IL-2的用量，降低LAK治疗的毒副作用，且CD3AK的抗肿瘤活性大大高于LAK细胞。山东胡伟等对晚期恶性肿瘤患者输注自体 CD3AK 细胞 1个疗程后,实体瘤组治疗有效率为 25.45%,临床获益率为 74.54%;淋巴瘤组有效率为 83.33%,临床获益率为 91.67%。,在利用外周血淋巴细胞制备免疫效应细胞的研究中，为增加效应细胞的数量和杀瘤活性，常添加一些激活剂如抗CD3单抗，植物血凝素PHA等，以提高免疫治疗疗效。实验显示PHA预刺激虽能促进IL-2激活的杀伤细胞的增殖，但对杀伤活性并无明显改善，而培养15天以上，经PHA预刺激的P-LAK和P-CD3AK细胞杀伤活性显著提高，且PHA与抗CD3单抗有协同效应。,3、TIL细胞,肿瘤浸润的淋巴细胞，是从新鲜的肿瘤组织中分离出来，体外经IL-2，抗CD3单抗，TNF等刺激，经20-45天培养，获得的具有一定特异性的抗肿瘤细胞。其局限在于分离困难，体外培养时间过长。,我们于1997-1998年选择21例癌性胸腹水患者，其中肺癌4例，乳腺癌5例，肠癌4例，骨癌7例，胰腺癌1例。所有病例均经病理学和细胞学诊断。共抽取33次胸腹水做TIL细胞培养，抽取胸水2502200ml，腹水量12004400ml。21例患者中14例经16次的TIL胸腹腔回输治疗。回输期间隔天皮下注射IL-2 50万单位。14例患者回输治疗结果显示总有效率为78.57%，其中3例胸腹水消失，并观察1个月无复发，1个月后检查胸腹水无瘤细胞；8例胸腹水有明显减少，并控制1个月以上；3例仅控制12周。,4、TAK细胞,TAK是由可溶性肿瘤抗原，抗CD3单抗和IL-2共同诱导的杀瘤细胞。用可溶性肿瘤抗原诱导细胞识别肿瘤，以提高杀瘤亲和性；用抗CD3单抗诱导所有T细胞活化，培养出以CD8+T细胞为主的杀瘤细胞。TAK细胞不仅增加了杀瘤的特异性，且体外增殖快，IL-2用量低。,我们用盐析法提取胃癌可溶性抗原（TSA），并用抗CD3单抗和IL-2共同刺激正常人的外周血单核细胞，培养10天后，经流式细胞仪表型分析，表明其免疫效应细胞以CD8+T细胞为主，其细胞增殖速度，增殖水平与CD3AK和LAK相比明显升高，且对抗原来源的胃癌细胞具有极强的杀伤活性（98.5%），高于CD3AK（82.1%）和LAK（62.05%）。,我们于1996-1998年，采用静脉或口服化疗和免疫效应细胞输注为主体的化学免疫疗法，治疗晚期原发性肝癌18例。收治的38例晚期原发性肝癌病人中，18例采用化学免疫疗法（甲组），同期收治的晚期肝癌患者，除对症处理外，单用静脉化疗或肝动脉插管化疗20例，列为对照组（乙组）。总缓解率（CR+PR）：甲组22.22%（4/18），乙组无1例缓解。,5、CIK细胞,是将人外周血单个核细胞经体外用各种细胞因子共同刺激培养所获得的免疫细胞。由于同时表达CD3和CD56分子，故又称为NK样T细胞，CIK细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，其抗肿瘤活性远大于LAK和TIL。因此被认为是新一代肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。刺激因子除了抗CD3单抗、IL-2外，还需用IFN-和IL-1等细胞因子。,CIK细胞杀伤机制,、识别 由于CIK的细胞杀伤作用是非MHC限制性的，故CD4、CD8在其识别肿瘤细胞或病毒感染的细胞过程中并非必不可少。细胞表面粘附分子LFA-1 ICAM-1在CIK细胞识别过程中起关键作用。对正常细胞无毒性作用。,、杀伤 CIK细胞对肿瘤细胞或感染细胞的直接杀伤：CIK细胞在受到外源性抗CD3McAb或敏感靶细胞刺激时会释放具有细胞毒性的胞浆颗粒物到膜外空间，其中CD3+CD56+细胞可产生最大的颗粒释放量。这些胞浆颗粒物对靶细胞具有直接杀伤作用。炎性细胞因子的杀伤活性：培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-、TNF-（肿瘤坏死因子-）、IL-2等，不仅对靶细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤靶细胞。诱导肿瘤细胞凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL（型跨膜糖蛋白），一方面增强了其对FasL+肿瘤细胞引发的Fas-FasL凋亡的抵抗性，还可通过对Fas+（型跨膜糖蛋白）肿瘤细胞诱导凋亡行使其对肿瘤细胞的慢性杀伤作用，保证抗瘤活性的长期持久。,CIK细胞的杀瘤特点,1、增殖速度快 CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%5%，在体外经多因子培养2830天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。且所占百分比也大幅上升，细胞毒活性亦达峰值。2、杀伤活性高、杀瘤谱广 CIK细胞的总杀伤单位（TLU）为LAK 细胞的73倍甚至更高，CIK细胞的瘤细胞抑制Log指数为2.53.5，较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2 个Log。其抗病毒活性大大增强。因没有T 淋巴细胞杀伤时的MHC 限制性，故对于多种肿瘤细胞系和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。3、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感 CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比较无差别。4、杀瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制剂的影响 免疫抑制剂CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）不影响靶细胞诱导的CIK细胞脱颗粒，并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。5、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小 CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，对GM-CFU（粒细胞巨噬细胞集落形成单位）仅有不足1级的抑制。6、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡 CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin的转录水平上调。CIK细胞具备合成FasL的能力，CIK细胞可以对抗体内FasL阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降。,CIK制备,采集：外周血单个核细胞。分离：PBMNC经淋巴细胞分离液分离、洗涤后悬浮于含10%AB血清的RPMI 1640中。培养：第一天培养加入-IFN 1000U/ml，24小时后加入IL-2 1000U/ml，在37，5%CO2孵箱中培养。以后每3天更换培养液补加IL-2 1000U/ml；培养710天。无菌检测：细菌霉菌培养阴性；热源检测阴性。收获：收集细胞，加入含1%白蛋白的生理盐水洗涤三遍。,CIK治疗,回输：洗涤后的细胞悬浮于1%白蛋白生理盐水中，将CIK细胞通过输血器经静脉输给患者。疗程：培养的第8-10天开始，分四次回输，每次间隔1-2天。自回输CIK细胞前一天起,连续每日静脉输注IL-2，每日剂量为100万单位直到回输结束。,观察指标,1、CIK培养前后免疫标志检测（包括CD3、CD4、CD8、CD3CD56等）2、CIK回输前后患者外周血免疫标志检测（包括CD3、CD4、CD8、CD3CD56等）3、CIK细胞回输前后患者不良反应的观察。,临床应用,体内回输C IK细胞,可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并可调节和增强机体的免疫功能。特别适应于那些对手术、放疗、化疗已无适应证的晚期肿瘤患者,因而成为治疗肿瘤的重要辅助治疗方法,为预防肿瘤复发、改善生存质量提供了新途径。一般在放疗、化疗后间隔24周,机体免疫力有所恢复时,输入C IK细胞,可提高肿瘤患者的缓解率并在清除微小残留病灶方面发挥重要作用。,Combined transcatheter arterial chemoembolization and cytokine induced killers for hepatocellular carcinoma,67 patients with hepatocellular carcinoma 21 patients were treated with TACE+CIK 46 patients were treated with TACE only.Result:The median survival period of controlled group and observed group is 22 months(95%C7,37),10 months(95%C8,12)respectively.The six-month,one year,and two years living rates were 85.71%,58.35%,48.62%and 69.05%,32.74%,3.97%respectively,Kaplan-Meier analysis survival for 67 hepatocellular carcinoma,典型病例,患者，男，61岁，于因“右上腹闷痛1周”住我院，入院查B超:右肝实性占位（结合临床：倾向原发性肝癌）伴门脉癌栓形成。MRI(NO.9401):1.右肝占位，考虑肝硬化恶变并门脉癌栓形成，肿瘤大小约：11.2x6cm。2.脾肿大并少量腹水3.双肾囊肿。AFP:204628ng/ml。诊断为：1.原发性肝癌伴门脉主干癌栓（IIIA期）2.乙肝后肝硬化3.右肺错构瘤术后4.C7、T9局部骨质缺损。入院后予、行介入治疗，共用FUDR3.0、艾恒600mg。同时配