经典液相色谱法.ppt

第十八章 经典液相色谱法,第一节 概述经典液相色谱法：采用普通规格的固定相，常压输送 流动相的液相色谱法称。,缺点：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 离线检测、分析周期长优点：仪器设备简单，费用低 对样品预处理要求不高 可同时分析多个样品分类：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法等 柱色谱法、平面色谱法应用：产品纯度控制、杂质检查、天然药物有效成分分离、中药定性鉴别等,第二节 液-固吸附柱色谱（如M.Tsweet法）,（一）分离原理（二）常用吸附剂（三）色谱条件的选择,（一）分离原理 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的 吸附能力差异而实现分离,（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质 1.硅胶 2.氧化铝 3.聚酰胺,吸附能力大小取决于吸附中心的多少和吸附中心与被吸附组分形成氢键能力的大小,1.硅胶（SiO2H2O）,结构：内部硅氧交联结构多孔结构 表面有硅醇基氢键作用吸附活性中心表面硅醇基存在形式：,游离羟基,吸附特性1：易吸水失活 105110烘干 0.51h(可逆失水)吸附力最大 活化（P469）：铺好的硅胶板自然晾干后，在烘箱中于 105110烘干0.51h的过程 500 烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力,表18-1 硅胶和氧化铝的含水量与活性的关系,活性级越大，含水量越多，吸附能力越小，活性越小 活性 活性级 吸附能力 吸水量,硅胶吸附特性2：与极性物质形成氢键,物质极性，吸附能力，k，tR,适用：分析酸性或中性物质,2.氧化铝 碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 45 适于分析酸性、中性物质,3.聚酰胺 氢键作用 氢键能力强，组分越后出柱,（三）色谱条件的选择：,1.被测组分性质（极性大小）：烃-羧酸，醇 判断物质极性大小的规律：基本母核相同，分子中基团的极性越强，整个分子的极性也越强 分子中双键越多，吸附能力越增，共轭双键多吸附力亦增大化合物基团的空间排列对吸附性也有影响。如能形成分子内氢键的要比不能形成分子内氢键的相应化合物的极性要弱，吸附能力也弱,色谱条件的选择依据被测组分、吸附剂和流动相的性质 极性,2.吸附剂的活性：吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强 强极性物质选择弱吸附剂 弱极性物质选择强吸附剂3.流动相的极性：流动相极性大，对被测组分的洗脱能力大“相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相 常用的流动相极性递增的次序是：石油醚环已烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿 醋酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水。,续前,续前,4.三者关系图示：组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性,第三节平面色谱法的分类和参数,分类薄层色谱法TLC：吸附薄层色谱法分配薄层色谱法纸色谱法PC:分配色谱法平面色谱参数 定性参数比移值Rf 相平衡参数K、k 分离参数分离度R,1、定性参数,比移值(Rf值)溶质移动距离与展开剂移动距离之比 Rf=L/L0（定时展开）L为原点（origin）至斑点中心（质量重心）的距离L0为原点至溶剂前沿（solvent front）的距离 类似保留时间（定距展开）与组分及色谱条件有关,2、相平衡参数,分配系数K=Cs/Cm 容量因子 k=CsVs/CmVmK、k与Rf值的关系：,讨论 Rf与K有关，即与组分性质（极性）以及吸附剂 和展开剂的性质有关；色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为,续前,1）K大，Rf小 2）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱）展开剂极性小，Rf小（不容易洗脱）3）Rf范围：0 Rf 1 Rf=0，K无穷大，组分在原点不动 Rf=1，K=0，组分斑点至溶剂前沿 Rf=0.20.8（常用）0.30.5（最佳）,影响比移值的因素,1）被分离物质的结构和性质2）薄层板的性质3）展开剂的极性4）温度5）展开槽内的展开剂蒸气饱和程度重现性差，多用于定性,3、分离参数分离度,分离度（R）两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（纵向直径）的比值,第四节、薄层色谱法(thin layer chromatography；TLC),（一）概述（二）吸附剂的选择（三）展开剂的选择（四）薄层板的制备（五）定性与定量分析,（一）概述,1定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程：见图示铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量),3分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）4特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：药物杂质检查、纯度测定 next,（二）吸附剂的选择 根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂 被测物极性弱强极性吸附剂,（三）展开剂的选择（同液固吸附柱色谱流动相的选择）根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性；遵循“相似相溶”原则 可用单一溶剂、二元、三元甚至多元的溶剂。常加入的酸性物质有甲酸、醋酸、磷酸和草酸等。常加入的碱性物质多为二乙胺、乙二胺、氨水和吡啶。,组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性,练习：A、B两组分TLC分离结果如下：,展开剂 A B苯 Rf=0.35 Rf=0.42苯-乙醇 Rf=0.38 Rf=0.52试问：A、B哪个组分极性大？答：乙醇极性苯极性 根据“相似相溶”原则，B极性大,（四）薄层板的制备,定性分析窄条定量分析1020cm,1、铺板：手工或用涂布器把浆状的吸附剂均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）,干燥、活化后即可使用,2、点样:用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开,3、展开：由一种或多种溶剂按一定比例组成。注意克服边缘效应(预饱和),总结：,制板均匀点样集中展开预饱和显色,（五）定性和定量分析,1.定性:Rf定位方法:直接法 254nm紫外灯下观察(硅胶GF254荧光板显紫红色斑点)有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅 笔将组份斑点描绘出来 喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。2.定量(薄层扫描法),第四节 纸色谱法paper chromatography,将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法,固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇）分离机制：液-液分配色谱定性参数：,讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留，Rf 小（流动相极性，Rf）非极性组分易洗脱，Rf大（流动相极性，Rf）,一、纸色谱法的实验条件,色谱纸的选择 对Rf值相差很小的化合物，宜采用慢速滤纸 对Rf值相差较大的化合物，则可用快速滤纸固定相：纸纤维吸附的水,纸色谱法的实验条件,展开剂的选择 增加展开剂中极性溶剂的比例量，可以增大Rf值 增加展开剂中非极性溶剂的比例量，可以减少Rf值常用的展开剂 水饱和的有机溶剂，如水饱和的正丁醇等操作步骤 点样、展开、显色、定性定量分析,主要内容：,比移值Rf及其与K和k的关系吸附薄层色谱法：原理，吸附剂、展开剂及其选择薄层色谱定性方法纸色谱法：原理和实验条件,练习：,P481，习题3，4，6,