细胞因子检测技术.ppt

细胞因子的检测,细胞因子（cytokine,CK）指由免疫细胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成与分泌的，具有多种生物功能的小分子蛋白质的统称。因能调节多种细胞的生理功能而得名。可介导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。,细胞因子,一、细胞因子概述,以生物学作用进行划分的分类,白细胞介素（Interleukin）IL-1、IL-2、IL-18干扰素（Interferon）IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulating factor）M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor）TGF-趋化因子（Chemokine）IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF,细胞因子间的相互作用,IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSF,TNF TGF IL-1 IFN,IL-1 IFN,TNFIL-1 TGF,IFNIL2 IL-4,IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6,TNF IFN IL-1 TGF,TNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSF,TNF,TNF IL-1 TGF,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF,IL-1 IL-6,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN,内皮细胞,成纤维细胞,T,B,二、细胞因子检测的方法与原理,（一）细胞生物学检测（二）免疫学检测（三）分子生物学检测,1、细胞增殖或增殖抑制试验2、细胞毒活性测定3、抗病毒活性测定法4、细胞趋化活性测定法,（一）细胞生物学检测,1、细胞增殖和增殖抑制测定法,以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。,通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。,结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定,优点,缺点,方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染,(1)放射性核素掺入法,特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关,测定步骤类似,相同点,不同点,与同位素掺入法相比,掺入物：MTT而非3H-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同,(2)MTT 比色法,2、细胞毒活性测定,对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。,本法常用于TNF等的测定,Wish、Hep2/c 人干扰素L929 小鼠干扰素Ratec 大鼠干扰素A549MDBK 多种族的IFN-和IFN-,本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（CPE）。,VSV、EMCV及Sindbis virus等,细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量,3、抗病毒活性测定法,常用于检测抗病毒活性的细胞株,常用于攻击细胞的病毒,检测抗病毒活性的方法,趋化性(chemotaxis)：诱导细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性(chemokinesis)：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。,趋化因子诱导细胞移动的方式,4、趋化活性测定法,滤膜：计数受趋化细胞,趋化因子,细胞,趋化试验原理示意,靶细胞的选择与培养,1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配,各类细胞因子检测的常用靶细胞,细胞因子 实验系统 干扰因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4,各类细胞因子检测的常用靶细胞,细胞因子 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN-、IFN-L929（M）病变保护法 IFN-、IFN-,敏感性较高特异性不高操作繁琐易受干扰,生物学活性测定方法学评价,（二）免疫学检测,细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。1、ELISA法2、酶联免疫斑点实验3、流式细胞分析法,1、ELISA方法,ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定,敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。,ELISA,特异、简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法,优点,缺点,2、酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot),在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。,一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关,基本原理,ELISPOT,3、流式细胞分析法,流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。,1分离和培养待检细胞 2细胞固定 3封闭非特异性结合位点 4染色与分析,基本步骤,细胞内细胞因子检测技术,激活,膜抗原标记,细胞内细胞因子标记,使用流式细胞分析法，可以：,区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1细胞 IFN-Th2细胞 IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态,免疫学测定方法学评价,优点：特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合,（三）分子生物学检测,此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。方法：1、Northern印迹杂交法2、Southern 印迹杂交法 3、PCR与逆转录PCR4、原位杂交，原位PCR和原位RTPCR,三、常用细胞因子的检测方法,IL-2的检测IFN-的检测TNF的检测,待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）,按不同稀释度加入,37C，16-20小时,加入3HTdR（1-5Ci）,37C，4-6小时,收集细胞,测定,白细胞介素-2的测定示意图,待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）,按不同稀释度加入,37C，4小时,37C，24-48小时,弃取上清，加入VSV,观察细胞病变（镜检或比色）,干扰素的测定示意图,肿瘤坏死因子的测定示意图,待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）,按不同稀释度加入,37C，24小时,弃取上清，洗涤,加入结晶紫染液，洗涤,加入细胞裂解液，比色,结束,谢谢大家,