种子资源分子技术.ppt

药用植物种质资源鉴定中的分子技术,内容,目的意义,分子标记技术,药用植物种质鉴定常用的分子标记技术,展望,概念,种质资源是育种学中的概念，在遗传育种领域中把一切具有一定种质或基因，可用于育种、栽培及其他生物学研究的各种生物类型总称为种质资源。药用植物的种质资源则是泛指一切可用于药物开发的植物遗传资源，是所有药用植物物种的总和。,种质的优劣对中药的产量和质量具有决定性的作用,因此药用植物种质资源的鉴定是准确确定原植物、确保药效、合理保存利用现有种质、寻找开发新的药用植物等研究工作的基础,在药用植物种质资源研究中具有重要意义。作为种质资源的鉴定方法,早期有形态学标记、细胞学标记与生化标记。然而,早期的鉴定手段都是针对基因的表达产物进行的,受环境影响较大,因此,如何从分子水平揭示种质间差异成为种质资源研究者十分关心的问题。,20世纪90年代分子标记技术被引入药用植物种质资源鉴定的研究中，极大地促进了该领域的发展，分子标记技术也越来越多的应用于各种属的药用植物的种质资源鉴定。根据其技术特点大致可以分为三类：电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,其代表性技术为RFLP；电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术,其代表性技术有RAPD和AFLP；DNA序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有ITS测序分析技术。,药用植物种质资源鉴定中常用的分子标记技术,1 限制性片段长度多态性(RFLP),限制性片段长度多态性(RFLP)是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,含同源序列的酶切片段在长度上的差异。Botsten等于1980年首先提出用RFLP构建遗传连锁图,其基本原理是将不同生物个体的基因组DNA分子采用适当的限制性内切酶切割,将酶切片断电泳后利用探针杂交并放射自显影,就可以得到与探针高度同源的DNA带型。由于植物不同种、属间甚至品种间同源序列的限制性内切酶识别位点各不相同,因此通过比较RFLP片段的多态性,就可以揭示种、属间甚至品种间的差异及相关性。,RFLP标记优缺点,RFLP标记具有共显性、可以区别纯合和杂合基因型、稳定、重复性强等优点。目前在某些生物体中开发的RFLP的探针已经遍及整个基因组。然而由于RFLP具有种属特异性，技术复杂，对DNA需要量大、纯度要求高且所需的放射性探针对人体危害大，所以使其应用受到很大限制，此技术在医学上有所发展外，在植物学研究上已经极少使用,在中药上的应用前景也不被看好。,RFLP标记的应用,2006年,高晓霞等利用真核生物通用引物扩增rDNAITS序列并对扩增产物进行RFLP分析,其ITS-RFLP酶切图谱显示可以对佛手和香橼基缘植物进行分子鉴定。2005年,张婷等对束花石斛、流苏石斛及其形态相似种进行研究,通过PCR-RFLP方法获得ITS片段的限制性图谱。结果显示根据所得的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。并用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。2004年,赵宣等人用PCR-RFLP方法成功的分析了牡丹组植物种间的关系,并获得了相应的分子证据。另外,苍术属、甘草属、北沙参、柴胡等也有应用RFLP进行资源分析的报道。,2 随机扩增多态性DNA(RAPD),随机扩增多态性DNA(RAPD)是利用一系列(通常是数百个)不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸(通常为910个碱基)单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过电泳分离、溴乙锭(EB)显色来检测扩增DNA片段的多态性,这些扩增的DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。,RAPD技术的优缺点,相对于RFLP来说,RAPD技术具有技术简便易行、成本低、DNA用量少、引物无种属特异性以及不使用放射性同位素等优点,其缺点则主要表现在稳定性差、易受外界条件影响、不能鉴定杂合子、结果分析较困难。RAPD技术发展极为迅速,广泛应用于各属种的种质资源鉴定研究之中,是目前种质资源鉴定中应用最多的分子标记技术。由于RAPD稳定性差,因此,在应用RAPD进行研究时,应积极摸索最佳反应条件以及各影响因子对反应结果的影响情况,以便于对研究结果进行比较,并为其应用于生产打下基础。,RAPD技术的应用,2007年,李明军等研究了山药基因组DNA的提取方法并对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,且声称建立了山药RAPD技术体系,得到了29个山药品种的RAPD指纹图谱,在分子水平上为山药种质资源的品种分类、质量评价以及核心种质的构建提供了依据。同年,严奉坤等建立了一种适于分析的快速提取枸杞叶片基因组的方法,并利用筛选出的2个随机引物对10份枸杞材料基因组进行了RAPD扩增,构建了枸杞属基因组指纹图谱,为运用RAPD技术对枸杞基因组进行指纹图谱分析从而进行道地品种的鉴别、遗传多样性及亲缘关系的研究提供了参考。其他如三七、山东瓜蒌、广藿香、天麻、冬凌草、贝母、巴戟天、苦叶七等药用植物也都有应用RAPD技术进行种质资源鉴定研究的报道。然而目前大部分研究还仅局限于探讨RAPD技术在某一种属药用植物种质资源鉴定中应用的可能性上。,3 扩增片断长度多态性(AFLP),AFLP是在RFLP和PCR的基础上发展起来的,其基本原理是通过选择性扩增基因组DNA的酶切片段来获得不同DNA样品之间的遗传差异。生物基因组DNA经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3-端选择性碱基的识别,对特异性片段进行选择性扩增。选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经凝胶电泳分离检测,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。,AFLP标记优缺点,AFLP技术兼有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性,具有快速、灵敏、稳定、所需DNA量少、多态性检出率高、重复性好、适应性广等优点,虽然存在着费用高、操作技术难度大等缺点,但依然被人们认为是一种十分理想的、有效的、先进的、最有力的分子标记。在药用植物种质资源鉴定上展现了广阔的应用前景。,AFLP技术的应用,2007年时,郝岗平等采用AFLP技术对山东产15个丹参样本进行DNA多态性分析,利用4对引物结合构建了15个丹参样本的DNA指纹图谱,分析结果表明AFLP技术可用于丹参道地性鉴别。2006年,张瑞等通过对影响重楼AFLP-银染技术体系的关键因素作对比研究,建立了一套优化的重楼AFLP分子标记体系。优化的关键因素为:1)DNA采用CTAB法从幼叶中提取;2)酶切时间为9小时;3)选择性扩增时退火温度为56;4)从15对引物中筛选出4对进行选择性扩增,得到扩增条带276条,其中多态性带201条(占72.83%)。张阵阵首次优化并建立了红花基因组的AFLP技术体系,在64对引物中筛选出了条带多且清晰的适合红花AFLP的48对引物组合,并通过反复的基因池筛选,选出了两条具有多态性的引物。构建某一种属植物的DNA指纹图谱是目前AFLP在药用植物种质资源鉴定研究中的主要应用方面。,2000年,罗志勇等就采用AFLP技术分析了人参、西洋参基因组DNA多态性,并成功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱,使AFLP技术有望成为一种独立的切实可行的手段应用于人参、西洋参等药用植物的鉴定方面。其他如石斛属、缬草属、绞股蓝、葱及韭等植物都有应用AFLP对其种质资源进行分析的报道,为今后进一步应用AFLP进行种质资源鉴定研究提供了参考。,理想的分子标记主要应具备标准:,1.具有较强的多态性;2.表现为共显性,因而能鉴别出纯合基因型和杂合基因型;3.选择中性(即无基因多效性);4.对主要的农艺性状无影响;5.经济方便和易于观察记载。,展望,虽然目前的分子标记技术已达几十种,然而没有一种技术达到了上述全部标准,这就要求我们在实际工作中要根据具体的实验材料和实验目的以及备选分子标记的技术特点采用相应技术以达到最好的效果。,随着分子标记手段的不断更新和完善,其应用的深度和广度的不断推进,我们相信,作为种质资源鉴定的崭新工具,分子标记在药用植物种质资源鉴定中的应用必将有更广阔的前景。,Thank you!,