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不同温度对细胞骨架的影响【摘要】：细胞骨架是维持细胞生命活动非常重要的结构成分,狭义上主要是指细胞质骨架， 其装配和解聚受酸碱度、温度和钙离子浓度等多种因素的影响。本文使用显示细胞骨架最常 用的考马斯亮蓝染色法初步探讨了酸碱度和温度对细胞骨架的影响程度。试验结果表明，不 适当的酸碱度和温度都会导致细胞骨架的解聚，光镜下呈现不同程度的云雾状和空泡状，云雾 状多出现在酸碱处理组，而空泡状多出现在温度处理组。【作者单位】：龙岩学院生命科学学院;10生物技术【关键词】：细胞骨架 考马斯亮蓝 酸碱度 温度目的 原理，材料，方法，预测结果，参考文献，设计依据一、实验目的通过本实验的学习，了解在体外，温度对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。L掌H考马斯亮藤P250对物细胴碍架染色的方法.L道辿对洋蔽内成观辎的处理，掌瓠植蛔曲骨架的制彖方法与障恋观慕二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装 配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度因素 的作用下，可进行装配或去装配过程。考马斯亮蓝法显示细胞骨架的原理1、蛋白质的细胞化学:(1) 蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基 酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的 细胞化学方法并不多，特异性也不强。(2) 目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显 示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。2、细胞中的细胞骨架成分：(1) 、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络 结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白 质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的 细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核 纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。(2) 、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转 换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓 冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系 统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一 种网状结构。温度对细胞骨架影响的原理；温度处理导致解聚的骨架蛋白分布于胞质边缘，解聚后微丝蛋白重排，胞质 内出现大面积，大小不一的空泡。经过一段时间不同温度的处理，细胞核有变小 的趋势，从何细胞骨架也有影响。三：主要仪器、试剂实验用品(1)材料 洋葱内表皮(2)器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计。普通冰箱、低温冰箱、培养箱，恒温水浴锅。四个培养皿，刀片，镊子试剂1. 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)50ml77ml0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液(PB，PH7.3)0.15mol/L NaCl双蒸馏水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO40.2mol/L NaH2PO43. M-缓冲液咪唑（PH 6.7）KClMgC12EGTAEDTA疏基乙醇甘油用 1 mol/L HCl 调pH 至7.2。4. 1% 的 Triton X-100/M-缓冲液5. 0.2%考马斯亮蓝R250染液甲醇冰醋酸蒸馏水6. 3%戊二醛-PB 溶液（PH7.3）23ml50mmol/L50mmol/L0.5mmol/L1mmol/L0.1mmol/L1mmol/L4mmol/L46.5ml7ml46.5ml四：实验方案步骤一：温度处理方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶，置于4个培养皿中,分别在-18 °C冰箱、4 °C冰箱、50 °C 培养箱和20 °C（对照）中处理1h。步骤二：细胞骨架的制片与观察首先将洋葱片放入装有pH值6.8磷酸缓冲液的小玻璃瓶中，使其下沉；然 后吸去磷酸缓冲液，用1%Triton X- 100处理25min （抽提骨架以外的蛋白质）； 吸去Triton X- 100后，用M-缓冲液洗3次，每次3min，洗涤的同时可以稳定 细胞骨架；再用3%戊二醛固定15min;吸去戊二醛后，用PBS洗3次，每次 3min;用0.2%考马斯亮蓝R250染色15min;用蒸馏水洗涤2次；取出洋葱鳞 茎内表皮，展平在载玻片上，空气干燥；最后镜检。（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次，3min/次）（2）、用 1%TritonX-100/M 缓冲液处理 15min （30min），室温或者 37C 均可。（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3 次 （3-5min/次），M缓冲液有稳定细胞骨架 的作用。（4）、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min （不制备永久装片，甲醇-冰醋 酸混合液。固定15-20min）。（5）、PBS液洗涤细胞若干次（3次，3-5min/次），用滤纸吸干。（6）、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min，小心用水漂洗，空气干燥，封片， 观察。（蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明，制成水装片）（7）、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本 上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰 富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤 维随之消失。取洋葱内皮1cm左右置于含PBS液的载玻片上1湿润后，吸去PBSI加2 滴1 %Triton X-100/M-缓冲液，15-30 min1吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min？1加PBS洗2次，共3minI加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min用PBS洗2次，共2min，吸干i镜检并绘图图4-4细胞骨架标本制作过程五：依据：在真核细胞的细胞质中分布着一种纤维状的结构系统，即细胞 骨架，它包括微管、微丝和中间纤维三种不同类型的纤维结构。这些骨架纤维是 由不同的蛋白质亚单位以特定的方式聚合形成的。正是因为这种独特的蛋白质组 成和结构特点，使得细胞骨架具有其特有的理化性质，一些能使蛋白质变性的化 学试剂（如秋水仙素、SDS）还有物理因素都可以使其或多或少地发生变化。六、实验操作注意事项：（1）、每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。PBS冲 洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的 观察。（2）、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度，建议 应控制在30min左右。七：实验结果：:V；.显微储昌R葱内表皮细也的轮廓清晰EK. CisllfflL细怛壁及JIJ界明 H皈I。倍镜下叩粗略溺廉到细胞内精细不等的蓝色纤维团块原成的网拭结 构ML细胞内各处Fi架的密集度不坷匀，细胞核M域;向纤维相削宫集，萤色浓 R-甚至分辨不出网络鲜构,另啊见蛔胸壁区域有零星蓝色叶维打布：相邻细 胞的密集料一度吊本一致，II.七小数细胞有较大不hL10X40借镜下可清楚双察到篮色的问状蜻构确实由线性纤维交织成，纤维间 的结合低稍膨大次骥边缘眉架较捕疏小口见山j胞壁相|诃心”的纤雄形成的 细胆质膜的轮廊与一细胞内部的纤维通过纵向的纤姓相连相部细脂有纤维岸过 胞间的细鹿K调书址微镜焦匝川观察到刎胞不同横切而的网络结构的变化.表 明现胞骨架以雄/怖结构的形式分布布整个细胞内“洋蒙内皮现ah中的Z2温度对洋葱细胞骨架的影响堵果温度对洋葱内表皮细胞骨架的影响(400 x)如图2所示。山图2可虻，在20力和4C处理的洋葱鳞茎 内表皮细胞中骨架清廉完成呈网络状分布。在- 18饥寸细胞骨架几乎消失，只留有部分细胞核:然而,在 5DQ处理后洋葱鳞茎内表皮细胞中骨架有解聚现象，但仞能见到部分细胞骨架所以推顼L洋慈鳞茎内表 皮细胞的骨架易受温度影响，低温对其影响较.北高温也有影响，怛不如低温的影响剧烈。A.-棒。处篷后的洋慈#由胆许架E4C夏理后的洋葱制胞骨架匚叫心处理片的祥葱朝胞骨架n so。英理:后的洋覆舫也骨架图N温度对洋恐内表度祯电骨架的影响实验心得整个实验做下来，感觉与其他那些照着实验讲义做的实验有很大不同，而这 样的实验一做确实发现我们在实验上的不足。进大学2年以来做实验都养成了照 着讲义按部就班的习惯，写起实验报告也有了自己一套惯用的格式，感觉实验不 过如此。而探究性实验的实验拿到手，面对空无一字的讲义顿时傻了眼，一下子 不知道从哪里入手，也不知道该做什么实验。所以觉得自己真的对一些生物知识 的兴趣少了些敏感、对一些实验知识的活学活用少了分独立。如果还有机会做样 的探究性实验的话，我们希望能把思维放得更广阔一些，使自己独立思考的能力 更强一些，在学习中思考，“学而不思则罔”，只有这样，才能在实验中有所收 获0A 一温度项蕴J13B.渥度甘I IH实验人员：戴婉妹8 张淑梅10钟颖婷24方寒梅38A一仙境顼匚用眼P闩B.温度WLH4° C20° 79° C 50° C18°