植物细胞培养及原生质体培养.ppt

第 十 章 植物细胞及原生质体培养,一、植物细胞培养：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。,（一）细胞培养(cell culture)的特性：1.植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；2.细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；3.细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350 um一400 um 的团块，悬浮培养较困难；4.培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应 5.培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。,1,(二)植物细胞培养的营养需求及培养基.营养需求：植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类：(1)无机营养:如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等；(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；,(5)植物激素:如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸类:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.2.培养基：(1)固体培养基：添加琼脂等(2)液体培养基：不加琼脂等,(三)植物细胞培养技术 实验室中有悬浮培养、固相化培养、单细胞培养（微室培养、平板培养、看护培养、悬滴培养、微滴培养）等多种培养方式。,1.悬浮培养法：植物细胞悬浮培养(cell suspension culture)即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床 上进行悬浮培养，这些细胞和小的聚集体来自愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植株，通过物理或化学的方法进行分离而获得。,(1)优良的悬浮细胞培养体系必需满足：A.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。B.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。C.生长迅速，悬浮细胞的量一般23天甚至更短时间便可增加一。,(2)培养过程：将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤，单细胞滤液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培养。(3)悬浮培养特点：培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0.25 x l0细胞ml 一0.5 x 10细胞m1。,(4)悬浮培养类型：A.成批培养(Batch culture)：成批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加，培养基营养的消耗及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。分缓慢转动培养（1-2rpm）、震荡培养（100rpm）、快速转动培养（80-120rpm）和搅拌培养。,B.连续培养(Continuous culture):是用一定容积的非密闭系统进行 细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。最大特点是细胞生长速率标准一致，新形成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。恒化控制：通过营养液或某一成分 恒浊控制：比浊计测定浑浊度而进行流量控制。,2.固相化培养技术：细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养液可以在基质中流动。,（1）固相化培养的特点：A.消除剪切力；B.细胞生长缓慢，促进次生代谢过程；C.细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产物积累；D.便于操作，不易污染。E.便于产物收集。,(2)固相化培养系统：A.平床培养：生长慢，代谢产物多，但不易放大。B.填充床培养：条件控制困难。C.膜生物反应器：采用一定孔径和选择透性膜来固定营养物，营养物可以通过膜渗透到细胞中。,3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方法。（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35左有的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25含5CO2空气的培养箱中培养，细胞即可生长成团。,（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。,（3）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。,（四）细胞培养过程：1.择适宜的外植体；2.诱导疏松愈伤组织；3.选择适宜的培养基；4.悬浮培养；5.悬浮细胞的继代与选择；6.悬浮细胞的同步化；7.悬浮愈伤组织形成及植株再生。,水稻细胞悬浮培养及植株再生：1.愈伤组织的诱导：(1)取水稻种子，人工去皮后用70酒精表面消毒2分钟，再用25次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动30分钟。(2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入附加2mgL 2，4D、3蔗糖、03酵母提取物的Ms固体培养基中，25黑暗下培养、诱导愈伤组织。(3)3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。(4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖,2单细胞分离(1)愈伤组织的细胞计数：取1g幼嫩、新鲜的愈伤组织以1：10(wv)加入o1(wv)的果胶酶(溶于培养液或06 mol/L 的甘露醇溶液中，pH35)。25，黑暗下静置1216小时，再用电磁搅拌器低速搅拌几分钟即可获的细胞悬浮液，然后用血球计数板计数。(2)单细胞的机械分离。称取适量的愈伤组织，放入适量液体培养基的三角瓶在120 r分、25，黑暗下悬浮培养。(3)悬浮液过滤：愈伤组织块在液体培养基中连续振荡培养3周后，用大约10 0目的尼龙网过滤，经过滤后可获得95左右的单细胞。(4)单细胞收集。过滤液用150r分离心5分钟钟，收集单细胞及小细胞团。,3.细胞悬浮培养：(1)计算细胞起始密度：离心后将23的上清液例掉，将剩余部分轻轻摇动，使细胞均匀悬浮，取1滴悬浮液滴于血球计数板上，以游离单细胞为基数，计算细胞密度。(2)测定细胞活力。酚藏花红染色法和二醋酸荧光素染色法：先配制o1酚藏花红水溶液，溶剂为培养液，二醋酸荧光素则先用丙酮配成5 mgml贮藏备用，使用时用培养液稀释为0.01%的溶液.将培养物和二醋酸荧光素溶液在载玻片上混合，再用o1酚藏花红水溶液作染料，滴一滴于载玻片上，与上述溶液混合，盖上盖玻片。酚藏花红能将死细胞染成红色，很快可在显微镜下观察，530分钟后改用相差和荧光显微镜，活细胞显示较强的荧光反应。,(3)细胞悬浮培养的诱导：将离心管中近l3的悬浮细胞培养物倒入三角瓶中，并根据所需要的起始密度补加新鲜培养基，悬浮细胞在120转分，25黑暗下培养。并定期计数细胞密度，计录并绘制细胞生长曲线 4细胞团和愈伤组织的再形成及植核再生 大约在悬浮培养2周后，将细胞分裂形成的小愈伤组织团块(直径约1525mm)及时转移到分化培养基上(Ms基本成分，附加03酵母提取物，03水解酪蛋白，10mgL KT04mgL NAA及70蔗糖)。连续光照，空温25。3周后即可分化出试管苗。如果不及时转移，愈伤组织团块很快失去分化能力，转入分化培养基后即停止生长，变褐，死亡。,三七细胞培养工艺：1.工艺流程：,2.工艺过程：（1）培养基 植物愈伤组织诱导及培养所用培养基为Ms培养基，烟酸0.5mg/l，肌醇100 mg/l，甘氨酸2.0mg/l及蔗糖30g/l，pH56pH58。（2）三七种质材料选择与处理 取34年生三七植株粗根，用自来水充分洗净再用70乙醇冲洗表面后切成小块，在70乙醇中浸泡2min再转移至01升汞溶液中浸泡20min然后用无菌水冲洗45次，备用。（3）愈伤组织诱导与培养：将上述无菌三七粗根小块组织接种于含2mg/l的2，4D、0.5mg/l KT 及10椰子乳的MS固体培养基中，于25的培养箱中培养40天，即可形成小的愈伤组织块，然后每隔30天进行一次继代培养。每次继代培养均取一块愈伤组织，如此多次继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。,（4）细胞悬浮培养:培养基为含l mg/l 2,4-D、0.05mg/l KT及l0椰乳的MS培养基pH5.8。l00ml三角瓶的培养基装量为25ml，高压灭菌20min冷却后按1-2g/L干重接种愈伤组织愈伤组织切成干重1mg 小块。于25摇床中以120转分钟振荡培养30天，即得三七悬浮细胞培养物。（5）三七细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养相同。在l0L搅拌反应器中加入培养液，培养液充满系数为0.75一0.80，灭菌后冷却至室温接种已培养2530天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞计为12g/L，在2526下，以60转分钟搅拌速度及06vvmo8vvm(vvm为每分钟单位体积培养液中通入空气的体积数)速度通气，并维持pH5.55.8培养30天，收获细胞。（6）细胞收集及干燥：每批细胞培养30天后，离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤3次，每次抽干，然后于30一40低温下真空干燥或冻干，即得三七培养细胞成品。,二、原生质体培养技术：通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出完整植株。,A-E,培养的欧当归(Levisticum officinale Koch)原生质体分裂再生成植株的过程 F-L,培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J.2n=22，K.L.多倍体.,A-D当归(Angelica sinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop)原生质体培养再生植株,原生质体培养的目的：（1）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。（2）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。（3）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。,自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。,(一)原生质体的制备：1、材料来源与预处理：（1）材料来源：可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。,（2）预处理：A.预质壁分离：17-20 酶液中静置半小时，再于2834保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；B.预培养:将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；C.暗处理:将室温下生长57个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力；D.光处理:将叶片于日光或灯光下照射26h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；E.低温处理:夏季应用的实验材料其萌动种子应于4过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。,2.制备原生质体的酶类：高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。,常用的酶类有：A.纤维素酶，如Onozuka R10及RS，国内常用的为EA3867，其中含少量果胶酶；B.果胶酶，如Macerozyme R10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2，作用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为01，悬浮细胞为005；C.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；D.半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;E 蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。,酶液配制：需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0.1mmol/l一10mo1l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8为宜；混合使用时为宜，降至48以下则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。,3原生质体分离及纯化（1）分离：原生质体分离有机械法及酶消化法，前者产量极低而不多用、后者又分步法及二步法。一步法是将材料在2l一28用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理224h。二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。,（3）纯化 需用不锈钢网或尼龙网(100目一400目)滤除较大杂物后再洗涤纯化。A.离心法:原生质体混合物于500l000 rpm离心5min,吸去上层液，沉淀再用与酶液具有相同糖浓度溶液反复洗涤3一4次，最后用原生质体培养液洗涤备用；B.飘浮法:离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细胞时可用20蔗糖离心，原生质体浮于液面碎片及老细胞沉降而得以纯化，但产量低，有时对原生质体造成损伤；C.界面法:利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，将原生质体混合物置于葡聚糖及PEG混合液中离心，即可从两相界面获得高纯度原生质体；D.滴洗法:原生质体混合物置于孔径8um滤器中，用洗液以l-2滴秒速度自然过滤洗涤，其过程勿使滤干，洗至一定程度后，用原生质体培养液混合备用。此法原生质体破碎少。,4原生质体活力测定 纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养测定方法有；（1）根据形态待征判断其活力：来源于叶片的原生质体，呈绿色及圆而鼓者为活原生质体；来源于愈伤组织及悬浮细胞者，胞质内原生质环流及布朗运动活跃者活力较高；（2）活体染色法：用0.1酚番红或伊文思蓝染色、不着色者为活原生质体，染色者为无活力原生质体；（3）荧光染料活休染色法：用双醋酸荧光素染色，染料可自由透过细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。,（二）原生质体培养：1.培养方法：（1）固体培养：平板培养法，1.2%琼脂,45 oC.（2）液体培养：A.浅层培养法:其过程是将1m1原生质体悬液置于直径4cm培养皿或25m1三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养初期振摇12次，防止粘壁；B.悬滴培养法:其过程系将原生质体悬液滴入培养皿盖内，其量分别为5一10、50100及100一200 ul等，保持一定滴距每皿由几滴至十几滴不等，培养皿加入浓度低于培养液的液体，再将皿盖翻盖于皿上并置培养箱中培养；C.双层培养法:先将固体培养基倾入培养皿内冷却成层，再将原生质体悬浮液置于已固化培养基上培养；D.看护培养法:在培养皿底层铺一层正常密度且经射线处理已失去分裂能力而有代谢活力的原生质体琼脂混合物作饲养层，再于其上接种一层低密度(5一lo个细胞m1)悬浮原生质体培养。,2.培养条件：密度：平板培养103104个/ml,液体培养104105个/ml温度：多数为25-28 oC,少数1637 oC光照：500 lx,18h 或2800 lx 连续光照 多数要求 黑 暗或弱光,3.细胞壁再生及细胞分裂：l一3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法或在稍微低渗溶液中出芽现象证实。也可用0.1%ST型或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围常在1一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同，常在190之间。,（4）愈伤组织形成及胚状体形成 原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长：A 形成细胞团，发育成愈伤组织；B.形成胚状体，再产生植株；C.形成愈伤组织，再形成胚状体。随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养34周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。,5.植株再生 除少数植物通过胚状体直接发育成完整植株外，大多经愈伤组织诱导分化形成芽及根再生为完整植株。当愈伤组织达到12mm时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于：(1)只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；(2)与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素;(3)在诱导器官分化过程中，一般采用15001x左右的高光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。无根苗转移至诱导生根的培养基上培养生根，其只含低浓度生长素，而不含细胞分裂素，无根苗一旦生根即可发育成完整植株。,（三）原生质体融合：在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形成完整植株。,特点：(1)可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；(2)可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广；(3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用(4)可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；(5)可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；,1.促融因素：植物原生质体培养过程，有时无需任何处理亦产生融合现象，为自发融合，但融合率极低。异源原生质体融合需某种外力作用才能实现。（1）NaNO3诱导，NaNO3 可中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低；（2）高Ca2和高pH值诱导，如烟草叶肉原生质体于pH 10.5，0.05 mol/LCaCl2 培养基中，37 保温，融合率可达25，并可获得杂种植株；(3)PEG诱导，在高浓度PEG溶液中，原生质体发生聚集作用，经稀释后，50以上原生质体发生融合作用，且对多种不同原生质体均有效；(4)高Ca2+、高pH值及PEG结合诱导法，此为方法(2)和(3)相结合的改良法，高Ca2+和高pH值对原生质体损伤小，但对培养细胞原生质体促融作用小于PEG。(5)其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合方法，。,2、融合过程：23%-30%高密度混合2X105个/ml,在培养皿内进行融合的具体操作是将两种原生质体高密度等体积混合，调整原生质体密度为2xl0个毫升，混合物滴于直径为6cm平皿内，每滴0.1 ml，每皿78滴，静置15min，令原生质体贴于平皿底壁，向每滴原生质体滴加0.1mL 30PEG溶液，于15 oC作用15 min，再用高Ca2+和高pH溶液轻轻洗涤原生质体，第一次用0.5 ml，第二次用l.0 mL，第三、四次各用2m1，每次间510 min 缓慢吸出上清液，再用培养基洗涤两次，每次3.05.0m1，间隔5 min,最后加2.03.0 ml培养液密封平皿后在26 oC下进行培养。,3.影响融合的因素：PEG,高Ca2+高pH处理时间。4.杂种细胞的筛选：（1）遗传互补筛选：（2）抗性互补筛选：（3）利用物理特性筛选：,2008年5月17日,