植物组织培养培养基.ppt

植物组织培养培养基,20130328,上节课小结,外植体的选择1、基因型；2、取材部位；3、取材季节；4、生理状态发育年龄；5、大小灭菌和外植体的消毒无菌操作技术细节决定成败，良好操作习惯的养成外植体的褐化及预防外植体的玻璃化及预防,培养基种类和特点,离体培养条件下，不同种植物的组织对培养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，植物组织培养才能成功。,培养基的发展简史,最早是Sacks（1680）和Knop（1681），他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。,culture medium,培养基：含有各种被培养生物材料所需要的营养成分的培养基质。培养基是组织培养中最重要的基质，选择合适的培养基对培养成功与否关系很大。培养基有各种种类，不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发表人的名字来命名，再加上年号，如White(1943)培养基，Murashing和Skoog(1962)培养基。,培养基的分类,培 养 基 种 类,完全培养基,初代培养基,继代培养基,固体培养基,液体培养基,基本培养基,诱导培养基,增殖和生根培养基,培养基的分类,根据培养基的无机盐成分和元素的浓度，可将培养基分为以下四类：1.富盐平衡培养基：MS培养基；LS培养基；BL培养基；BM培养基；ER培养基等。2.高硝态氮培养基：B5培养基；N6培养基；SH培养基等。3.中盐培养基：Miller培养基；H培养基；Nitsch培养基；Blaydes培养基。4.低盐培养基：White培养基；WS培养基；HE培养基；改良Nitsch培养基及HB培养基。,常见培养基及特点,MS培养基：1962年由Murashige和Skoog为烟草细胞而设计的。,MS培养基特点,特点是无机盐和离子浓度较高（钾盐、铁盐、硝酸盐含量均较高），特别是硝酸盐含量较其他培养基高，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力,是一种较稳定的平衡溶液。微量元素种类齐全，浓度高；培养基营养丰富，在一般的培养中，无需额外加入氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。能加速愈伤组织和培养物生长。广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养效果良好。有些培养基是由它演变而来。,MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，MS液体培养基用于细胞悬浮培养,都能获得明显成功。,MS培养基特点,B5培养基,1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。,较含有较高的硝酸钾,较低的铵和较高VB1，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。实践表明有些植物在B5培养基上生长更适宜，如南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。,B5培养基的特点高硝态氮培养基,五个桑树品种芽再生的比较,White培养基低盐培养基,是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MeSO4的浓度和增加了硼素。无机盐量较低；有机成分含量相对也较低。适合生根培养、胚胎培养等。,SH培养基高硝态氮培养基,特点与B5相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。无机盐浓度较高。,WPM培养基,WPM(Woody Plant Medium),N6培养基高硝态氮培养基,是1975年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的,获国家发明二等奖。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养基和其他组织培养。主要特点：成分简单；硝酸钾和硫酸铵含量高；适合花粉、花药培养。,KM-8P培养基,有机成分复杂，包括了所有单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸；主要用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)。,培养基的组成成分,培养基的成分,植物激素,无机盐,有机物,培养体支持材料,辅助物质,水 分,一、水,培养基大部分是水，配制培养基时一般用三级水(水中不含或少含某些离子)，保证培养基中成分完全人为控制。水的作用 1.水是细胞原生质的主要组成成分；2.水是重要代谢过程的反应物质和产物；3.细胞分裂及伸长都需要水分；4.水是植物物质吸收和运输及生化反应的良好溶剂；5.水能使植物保持固有姿态，有利于光合作用和传粉；6.调节植物体周围的温、湿度，维持植物体温稳定。总之，水是植物原生质体的组成成分，是一切代谢过程的介质和溶液，是生命活动过程中不可缺少的物质。,二、无机盐,大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等元素。以盐的形式加在培养基中，它们对植物细胞和组织的生长都是必不可少的，需要量大于0.5mmol/L。其中特别说明的是：培养基中无机氮的供应可以有两种形式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。微量元素：Fe，Mn，Zn，B，Cu，Co，I等。对于植物细胞和组织的生长需要量小于0.5mmol/L，但必不可少，其中Fe较为关键，以螯合形式提供，可使用FeSO4.7H2O和Na2-EDTA进行制备。,大量元素的功能,（1）N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3N和NH4N两种形式供应。大多数培养基既含有NO3N又含有NH4N，NH4N对植物生长较为有利，供应的物质有KNO3、NH4NO3等。也添加氨基酸来补充氮素。,（2）P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物培养过程中，向培养基内添加磷、不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。,大量元素的功能,（3）K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为13mg/L为好。制备培养基时，常以KCL、KNO3等盐类提供。,大量元素的功能,（4）Mg、S和CaMg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H2O提供。用量为1-3mg/l较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2H2O提供。,大量元素的功能,微量元素的功能,铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢等酶的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制作培养基时不用FeSO4和FeCl3（因其在PH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀），而使用FeSO47H2O和Na-EDTA的结合成的结合物。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,三、有机物,有机化合物（organic compound）培养基中只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium）。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的的有机成分要以下几类：,维生素,肌 醇,氨基酸,天然复合物,碳水化合物,碳水化合物,最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖，可支持许多组织很好生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%。但在胚培养时采用4%15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制订配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的棉白糖代替。,维生素（vitamin）,这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养基中都能合成所必须的维生素，但在数量上还明显不足，通常需要加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有VB(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡多醇)、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸)，有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mg/L。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC有防止组织变褐的作用。,肌醇（myoinosltol）,又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为100mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,天然复合物,天然复合物的成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，它对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,氨基酸,是很好的有机氮源，可直接被细胞利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解物，是含有20种氨基酸的混合物，用量在10-100mg/L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,四、植物激素,1）生长素类（auxin）：生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受体内酶的分解，组织培养中常用人工合成的生长素类物质。2）细胞分裂素类（cytokinin）：这类激素是腺嘌呤的衍生物，多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养中使用较少或用量较低。,3）GA（gibberellic acid 赤霉素）：有二十多种，组织培养中常添加的是GA3。它主要是促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,五、辅助物质,抗生素（antibiotic）添加抗生素可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间；抗生素各有其抗菌谱，要选择加以利用，也可两种抗生素混用；应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用；不能因添加抗生素，而放松灭菌措施；此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来。,活性碳（Active carbon）活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用。它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附力越强；温度低吸附力强，温度高吸附力弱，甚至解吸附。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、琨类物质以及蔗糖在高压消毒只产生的5-羟甲基糖醛，极少量的活性炭就可以完全吸附培养基的激素。活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。活性炭易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。因此，在使用时不能随意添加，要有量的意识，物尽其用。,六、培养体支持材料,琼脂（agar）：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40C即凝固为固体溶胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90C以上的热水。琼脂的用量在6-10g/L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度太低，凝固性不好。颜色浅、透明度好、洁净的为上品琼脂。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、PH值等因素有关。长时间的高温会使凝固力下降，过酸过碱会加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,第二节、培养基母液的配制和保存,经常配制培养基时，为减少工作量，减少称量的误差，一般配成比所需浓度高10100倍的母液，用时可按比例稀释。配好的母液需要贮存于2-4的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。,母液配制流程图,确定培养基,称量,计算,溶解,分装,定容,贴标签,保存,母液配制视频,培养基配制流程,量取母液,调pH值,加入蔗糖/激素,灭菌,加琼脂/活性炭,分装,定容,加抗生素/激素,确定配方,分装备用,当培养基配制好以后，应随即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存)，培养基pH值调整可用1mol/L HCl或1mol/LNaOH。经高压蒸汽灭菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度会增加，即pH值可降低0.2。因此在实际操作中，经常在灭菌前将培养基的pH调节至比所需pH高0.2个单位。培养基的pH值(培养基的酸碱度)，直接影响到培养物对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响，此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好的凝固。,pH值的调整,培养基配制视频,培养基的选择,首先查找文献，找出同种或近源种外植体组织培养所用的培养基。,成熟的培养基,无相关报道,有种内或种间报道,植物再生能力的种间差异,Morus alba L.White Mulberry(E Asia)Morus australis Poir.Chinese Mulberry(SE Asia)Morus celtidifolia Kunth(Mexico)Morus insignis(S America)Morus mesozygia Stapf African Mulberry(S and C Africa)Morus microphylla Texas Mulberry(Mexico,Texas(USA)Morus nigra L.Black Mulberry(SW Asia)Morus rubra L.Red Mulberry(EN America)Morus notabilis,Morus indica cv.K2,20130425,建立新培养基的原则,在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,一、单因子试验,在单因子试验中由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如MS基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。,试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有410瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。,二、多因子试验,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验,如下表：,2种激素5种水平的实验组合,现实与理论的冲突,正交实验的概念,完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。,三、逐步添加和逐步排除的试验方法,在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,四、广谱实验法,在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)生长素细胞分裂素,对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度,4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示,例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。,思考与练习,如何配制MS培养基母液？配制培养基有哪些流程，哪些地方需要特别注意？如何筛选理想的培养基配方？,1,2,3,培养基的选择,在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,一、单因子试验,在单因子试验中由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。,试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有410瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。,二、多因子试验,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验,如下表：,2种激素5种浓度的实验组合,完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。,三、逐步添加和逐步排除的试验方法,在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,四、广谱实验法,在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)生长素细胞分裂素,对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度,4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示,例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。,思考与练习,如何配制MS培养基母液？配制培养基有哪些流程，哪些地方需要特别注意？如何筛选理想的培养基配方？,1,2,3,