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最新：结核病实验室加强实用手册(2022更新)解读及对加强我国结核病实验室摘要2023年1月，世界卫生组织发布了结核病实验室加强实用手册(2022更新)。本手册系统更新并描述了实验室网络加强的相关内容，为了便于相关人员更充分地了解本手册的内容，笔者就该手册的重点内容进行概括和解读，并提出加强我国结核病实验室网络建设的思考。关键词：结核；实验室手册；质量控制；指南我国是结核病及耐药结核病高负担国家。2022年全球结核病报告显示,2021年估算我国新发结核病患者78(66.590.5)万例，耐多药/利福平而寸药结核病(multidrug/rifampicin-resistanttuberculosis,MDRZRR-TB)患者33(2.73.9)万例。但结核病病原学阳性率和MDR/RR-TB检出率仍然较低，前者仅为58%,即约40%的患者为临床诊断疑似患者低于全球平均水平(63%)。而MDR/RR-TB实际检出16826例，仅占MDR/RR-TB估算患者的51.0%,即约50%的MDR/RR-TB患者未被诊断1。因此，加强各级实验室检测能力和质量，加强实验室检测与临床的关联，优化整个诊断流程和患者就诊路径、缩短时间间隔对于整个结核病防治工作非常重要。2023年1月，世界卫生组织(WOrldHealthOrganization,WHO)发布了结核病实验室加强实用手册(2022更新)(简称手册)2o该手册是对2017年版结核病实验室加强实用指南的更新，其系统更新并描述了结核病实验室网络加强的相关内容。笔者针对该手册的重点内容进行概括和解读，并就其对加强我国结核病实验室网络建设提出思考。一、更新推荐的实验室检测方法及其他更新内容自2017年以来，更多的结核病及耐药结核病实验室技术被WHO推荐使用，同时广泛耐药结核病(extensivedrug-resistanttuberculosis,XDR-TB)和准广泛耐药结核病(pre-extensivedrug-resistanttuberculosis,Pre-XDR-TB)的定义及治疗方案也发生了改变和更新，因此本手册也进行了相应的补充和更新。(-)推荐方法实验室检测技术贯穿于WHO已经发布的关于结核病预防、筛查、诊断、治疗及管理五大类结核病相关综合指南模块中。除了以往常规推荐的方法，如涂片镜检(萋-尼染色、传统荧光镜检、发光二极管荧光镜检)、分离培养(固体和液体)、表型药物敏感性试验(固体和液体)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分子生物学检测(GeneXPertMTB/RIFxLoopampMTBC)x耐药基因检测技术(GenOTyPeMTBDRplus.NTM+MDRTBsGenoTypeMTBDRsl)x结核分枝杆菌潜伏感染检测(结核菌素皮肤试验和Y-干扰素释放试验)外，补充了新推荐的技术,包括MTB及耐药基因检测技术,如Gene-XpertUltra.GeneXpertMTB/XDR、TruenatMTBsMTBPlus、MTB-RIFDxsAbbottReaITimeMTB、MTBRIFINHxBDMAXMDR-TBxHainFIuoroTypeMTBxMTBDR、RochecobasMTB、MTBRIFINHsGenoscholarPZA-TB;侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖(IateralflowIipoarabinomannanassay,LF-LAM)技术,用于结核病合并HIV感染的抗原检测。对于潜伏感染的检测并未就新型皮肤试验单独列出，但在世界卫生组织结核病综合指南模块3:结核分枝杆菌潜伏感染诊断方法3文件中明确列出。以上每一种WHO推荐的用作结核病初始诊断的分子生物学方法,都被批准用于成人和儿童的痰标本和支气管肺泡灌洗液检测。同时还明确GeneXpertMTB/RIF技术可通过检测胃液、鼻咽吸出物和粪便标本的MTB,用于儿童结核病的诊断，通过检测脑脊液、淋巴结抽吸物、淋巴结活检、胸腔积液、腹腔积液、心包积液、滑液或尿液标本中的MTB,用于相应肺外结核的初步诊断。GeneXPertUltra还可通过检测脑脊液、淋巴结抽吸物、淋巴结活检标本，用于肺外结核的初始诊断。其他WHo推荐的分子生物学快速诊断方法应用于除痰标本和支气管肺泡灌洗液之外的其他类型标本的有效性，目前证据不足。除了以上推荐的技术外，进一步明确了不建议使用的方法和场景，主要因为现有的证据还不足以支撑其预期用途，包括去污染浓缩集菌技术用于抗酸杆菌涂片镜检、噬菌体噬斑法快速检测利福平耐药性、薄层琼脂法用于快速培养和药物敏感性试验。对商品化血清学试验、皮肤试验和Y-干扰素释放试验用于活动性结核病的诊断，WHO虽然进行了评估，但仍不推荐其应用于中低收入地区活动性结核病的诊断。(二)其他更新内容除了上述对于具体技术的更新外，还更新了关于LF-LAM及Y-干扰素释放试验的应用指南；符合WHO最新建议的诊断流程；实施实验室质量管理的可用工具；评估、分析和优化结核病实验室诊断网络的进展等。在耐药监测方面，除了可以使用以往广泛应用的表型药物敏感性试验外，明确WHO推荐的分子耐药检测技术和二代测序(nextgenerationsequencing,NGS)均可应用于监测。二、实验室网络加强实验室网络的主要作用是为实验室所在地覆盖的人群提供优质的检测服务。(-)实验室网络架构公共卫生系统内的结核病实验室网络通常为分层或金字塔结构。实验室网络应使用更加准确的检测技术，拥有高效的标本转运系统，使用标准化操作程序和适当的质量保证流程，拥有足够的生物安全设施和人力资源。这些技术性内容在后续第三部分重点技术内容进行详细介绍。一般来说，基层实验室（对应于我国的县区级）检测服务往往是综合性的，其应该能够提供一系列基本的检测方法，但通常标本需要转运至中间级别的检测机构（如对应于我国的地市级结核病实验室）来完成一些比较复杂的检测，如耐药检测和菌种鉴定等。中间级别实验室提供的服务应该涵盖基层实验室提供的所有检测服务，另外也可能需要将某些标本转运至更高级别的实验室进行检测。高级别实验室（对应于我国省级和国家级实验室）则除了具备低级别实验室提供的所有检测服务外,还应提供一些更加复杂的技术，如基因组测序等。手册中列出了每种级别的实验室的主要职能。基层实验室主要侧重于提供检测服务及相关质量控制活动，中间级别实验室则在常规检测服务提供的基础上，负责对下级实验室提供质量保证和培训等活动，而高级别实验室则在常规检测的基础上额外增加了要加强与结核病防治规划的沟通、制定有效管理结核病实验室网络的计划、根据WHO的政策和建议开展NGS检测支持耐药监测、更新和下发实验室手册、监督下级实验室检测服务的实施、提供质量保证、确保制定适当的人力资源发展计划、开展耐药监测、开展与实验室网络相关的实施性和应用性研究、与国家级或跨国结核病实验室建立联系并接受质量控制、实施和验证新诊断工具的效能、协助其他实验室制定发展策略等。不同级别实验室数量的设置应根据社区和当地结核病流行病学的需求进行调整，即实验室提供的检测服务和达到的数量目标应基于患者就诊需求而非简单的依据行政覆盖人口计算，实验室网络的架构也必须以患者能够获得优质诊断服务为目标。（二）结核病诊断网络实验室检测服务仅是诊断过程的一个环节。应加强实验室检测与临床的关联，优化整个诊断流程和患者就诊路径。需要定期对结核病诊断流程进行评估和分析，以了解一个国家或地区的诊断服务是如何组织和执行的，识别出存在的差距，从而确定诊断服务中需要优化的领域。每隔24年还要对诊断流程进行重复审查，以衡量和评估诊断网络改进的进展，并确定需要进一步改进的领域。手册中列出了10条结核病诊断网络要达到的核心能力和标准，各国家或地区应建立对诊断网络的全面评估和分析工具，该工具要覆盖整个诊断网络环节，而不是局限于某一个环节（例如单纯的检测环节）。美国国际开发署开发了一种结核病网络评估工具（称为TBNet）,该工具使用半定量评分程序来确定诊断网络各方面所处的阶段，以帮助衡量当前结核病诊断流程是否完善，并协助确定需要改进的领域。通过评估和分析识别出需要改进的领域后，手册建议要提出基于证据的干预措施，以提高诊断网络的总体能力。（）检测流程手册中列出了4个WHO推荐的检测流程：流程1是肺结核和肺外结核患者诊断及进一步接受药物敏感性试验的首选检测流程。在该流程中，WHO推荐的分子快速检测方法被用作初始检测方法，以检测MTB及其对利福平和异烟脱的耐药性；流程2使用LF-LAM协助诊断结核病合并HIV感染者;流程3是针对MDR/RR-TB提供二线抗结核药物敏感性试验的检测流程；流程4是针对异烟脱耐药结核病患者的后续检测流程。检测流程应定期审查和更新，不是一成不变的。设计或审查检测流程时应考虑以下因素服务人群特征（风险群体、耐药比例、HIV感染比例、肺外结核或儿童结核病的比例等），这些特征最好来源于基于人群的研究；正在使用或计划使用的检测方法；检测方法是否被WHO推荐及预期用途如何；实验室基础设施，以及能够熟练操作相应检测方法的人员情况；标本采集和运输系统的充分性和有效性，以及各级别实验室之间的平均周转时间；提供诊断和治疗的临床服务能力；用于治疗结核病的药物的可及性等。（四）实验室网络加强的目标和监测指标终止结核病策略呼吁尽早诊断结核病，且每例患者都能接受药物敏感性检测（目前接受药物敏感性检测的定义为:对所有细菌学确诊的结核病患者至少开展利福平敏感性检测并对所有RR-TB患者至少开展氟瞳诺酮类药物的敏感性检测）。在结核病防治规划中实现这一目标的先决条件是有质量保证的实验室网络。以往某一国家或地区的实验室检测能力是基于每10万人口中提供涂片镜检服务的实验室数量，以及每500万人口中提供培养或药物敏感性试验服务的实验室的数量评价的。随着诊断技术的进步，考虑到每个国家的疫情水平，以及患者对于诊断技术可及性的差异（如城市和农村人口间、不同标本转运系统间）等，以往指标显然不再适用，因此，手册中列出了终止结核病策略的3个目标下的共12个核心指标以监控实验室网络的有效性：目标一为增加快速且准确检测结核病技术的可及性，包含5个指标，分别为指标1:国家制定的检测流程是否明确WHO推荐的方法作为具有结核病可疑症状和体征的患者的初始检测方法?指标2:新发和复发结核病患者中以WHO推荐方法作为初始检测方法的比例?指标3新发和复发结核病患者中经细菌学确认的比例?指标4使用WHO推荐方法的实验室中已建立实验室信息管理系统的比例?指标5:国家政策中是否明确结核病防治规划提供的结核病诊断和随访检测是免费的，或者可以通过医保报销。目标二为每例患者都能接受药物敏感性试验，包含3个指标，分别为指标6:国家政策和检测流程是否明确每例患者均应接受药物敏感性试验?指标7:细菌学确诊结核病患者中有利福平耐药检测结果的比例?指标8:RR-TB患者中有氟喋诺酮类药物和二线注射类药物耐药检测结果的比例（对于指标8,笔者认为随着组成MDR/RR-TB治疗方案中药物的更新，如贝达唾琳和利奈嘤胺作为A组药物而二线注射类药物阿米卡星作为C组药物，该指标内容也应进行相应更新，即应修改为利福平耐药患者中有氟唾诺酮类药物和至少一种其他A组药物检测结果的比例）。目标三为加强实验室检测服务质量，包含4个指标，分别为指标9:对所有检测方法监测质量指标纳入室间质量评价系统中的实验室的比例?指标10:开展药物敏感性试验的实验室通过熟练度测试的比例?指标11:开展培养、线性探针或表型药物敏感性试验的实验室实施质量管理体系的比例?指标12:国家结核病参比实验室目前是否通过医学实验室-质量和能力要求"（ISO15189）认可？三、重点技术内容（一）标本采集、运输和接收健全的诊断网络需要良好的标本转运系统支撑，手册强调了标本采集的注意事项（痰标本、最新推荐的粪便标本及用于LF-LAM检测的尿液标本）、监督第一次标本采集过程的重要性，还列出了本地和国际运输的标本包装和运输注意事项及标本登记、转运及申请单的示例。（二）质量保证质量保证是实验室质量管理体系（qualitymanagementsystem,QMS）的一部分，是确保实验室内所有过程质量所必需的，也是ISO15189要求的，应被视为日常工作的组成部分，以下为质量保证的关键活动。1 ,培训和能力评估：WHO前期已经撰写了一些培训教材，同时强调培训教材应因地制宜进行修改。2 .仪器设备验证：仪器开始用于临床标本检测之前及校准或维修之后，应通过使用已知阳性和阴性结果的标本进行验证，评估仪器是否符合预期用途。3 .仪器设备维护：豆牛仪器设备应制定预防性维护和校准计划。4 .方法验证：实验室中使用的所有检测方法必须经过验证，以符合其预期用途。对于商品化检测方法，根据预期用途使用时，一般不需要额外的大规模实验室评估,除非一些实验室认为特定的国家或地区的因素（如不同耐药相关位点突变的发生率等）可能导致该检测方法的性能与制造商描述的结果或其他评估研究的结果差异很大时，可进行大规模评估研究以确认性能。如果实验室执行非标准或修改的方法，超出预期用途（如未经验证测试的标本类型）使用或使用实验室内部开发的方法,应在开始检测临床标本之前进行更广泛的方法验证。5 .质量控制：质量控制通常在检查患者标本的同时，以同样的流程检查质量控制品或已知结果的质控物质，以监控整个检验过程的准确性和精密度。如果同批次的质量控制结果不可接受，则不得向临床报告患者标本检测结果。最常见的质量控制物品包括已知特征的MTB或非结核分枝杆菌菌株、水或去污染溶液(即阴性质控品)、来自已知特征菌株的DNA提取物等。质量控制也可以内置在检测设备或试剂中，并且在每次测试中自动进行(例如GeneXpertMTBRIF)o然而，此类内部质量控制仅为检测程序的一部分，可能仍需要定期进行传统的质量控制。6 .新批次试剂测试:在新批次试剂用于临床测试患者标本之前进行。如试剂是集中采购，然后分发到基层，则在分发到基层之前集中进行新批次试剂质量测试。需要注意的是，分发到基层的运输过程也可能会对试剂产生影响，因此，在对临床标本进行测试之前，强烈建议在最终使用用户现场进行测试。7 .室间质量评价(externalqualityassessment,EQA):应确保所有检测方法都包含在EQA计划中。能力测试是最常见的一种EQA方法，虽然能力测试并不能准确衡量实验室的日常表现，但有助于发现实验室存在的重大问题，建议每年至少进行1次能力测试，亦是ISO15189的要求。8 .质量指标监测：质量指标的日常监控是质量保证的关键要素，也是ISoI5189的要求，应与EQA计划一起实施。实验室应至少每月使用标准的表格收集并分析每一个检测项目的数据。应为所有质量指标设定目标值，并记录和调查质量指标中任I可无法解释的变化(如错误率增加、MTB阳性率或利福平耐药率的变化，或检测工作量的显著变化)，且必须与纠正措施联系起来。记录纠正措施及采取纠正措施后，该质量指标的后续改进和标准化亦至关重要。各实验室尽量使用统一标准的质量指标，以便进行各实验室间的比较。另外，结核病实验室网络还应建立一个向国家结核病参比实验室和结核病防治规划集中报告月度质量指标的系统。9 .质量改进：质量改进是质量保证过程中一个关键但经常被忽视的部分。可通过多种方式识别现有和潜在存在的缺陷和不符合项，如通过能力测试、审查质量指标、工作人员和评审员报告的问题、常规检测和质量保证活动中发现的不符合项等。还要明确规定识别不符合项、确定责任、召回与不符合项相关的临床报告结果的程序，并在采取纠正措施后恢复常规临床检测，同时要防止未来同样的问题再次发生。()实施质量管理体系质量管理体系指指导和控制某一机构质量相关的一系列协调活动。实施质量管理体系是一个复杂的过程，需要适当的基础设施、人员、设备和试剂耗材等，还应建立所有过程的标准化程序和文件，并监控检测过程涉及的所有阶段。对于大多数基层实验室来说，要达到国际认可所需的质量标准(如ISo15189)是非常困难的，但满足最低标准以确保准确可靠的检测结果仍然很重要。本手册中列举了一些目前可用的实施质量管理体系的文件和工具Q:ISO15189:2012医学实验室质量和能力要求文件、WHO开发的实验室质量管理体系手册和培训工具包、全球结核病实验室倡导组织(GlobalLaboratoryInitiatiVe)开发的逐步实现结核病实验室认可网站、WHO发布的逐步实现实验室质量改进以达到认可清单(StePWiSelaboratoryqualityimprovementprocesstowardsaccreditation,SLlPTA)、加强实验室管理以达到认可培训教材(strengtheninglaboratorymanagementtowardaccreditation,SLMTA)s加强结核病实验室质量管理以达到认可培训教材(TBSLMTA).结核病实验室质量管理体系得分计算工具包(SCore-TBPaCkage)等。(四)生物安全在结核病实验室建立和维持一个具有最佳实践的安全工作环境至关重要。管理、环境设施和个人防护对于确保人员、样本和周围环境的安全并保证检测质量非常重要。手册列举了一些常见检测技术的风险以用于风险评估，然后概括介绍了实验室设施要求、个人防护、应急事件处理、职业卫生、废弃物管理等。(五)实验室信息管理所有实验室都应建立数据管理系统，手工版或是电子信息化系统均可。信息管理系统通常包括以下内容：申请检测、标本的采集和管理、向临床医生报告检测结果、工作量统计、实验室质量指标、质量控制和EQA流程、库存管理，其他功能如账单、评审管理、标本条形码读取、仪器校准和维护等，还要记录每个活动的时间（如标本采集、标本接收、检测、结果报告等）以便计算每个检测项目的实验室周转时间等。（六）人力资源随着实验室网络的建立或扩大及技术能力的提高，人力资源数量和能力也应得到相应提高。实验室需要定期评估人力资源状况，并结合当前和预期未来一段时间的工作量，用以发现需要重点解决的人力资源方面的薄弱领域。手册中也列出了一些最常用的各项检测技术的日均和人均最大工作量。（七）将实验室检测服务与结核病患者诊疗密切关联通常实验室服务质量的改进或引入某一个新的实验室检测项目时往往只关注实验室检测本身（即检测阶段），而检验前和检验后阶段的改进也非常重要，如通过对医生、护士及其他相关人员进行培训I,通过实验室和临床、规划等部门召开的例行报告、会议或其他沟通机制来加强临床与实验室的衔接和交流。四、对我国加强结核病实验室网络的启示(-)实验室网络我国的四级实验室网络，即县(区)级、地(市)级、省级及国家级实验室网络架构较为完善，各级网络实验室职能与手册中描述类似。对于手册中用于监控实验室网络有效性的12个核心指标，目前我国通过信息系统填报和常规能力测试开展了大部分指标的监测，但指标4关于建立实验室信息管理系统、指标9关于质量指标监测并纳入EQA系统及指标11关于实施质量管理体系的实验室比例还未列入日常收集，这些指标对于服务提供及时性、质量改进非常重要，未来应列入监测计划。手册中建议网络中每种级别的实验室数量应根据社区和当地结核病流行病学的需要，以患者获得优质诊断服务为目标而非简单的覆盖人口进行设置和调整，而我国开展结核病实验室检测服务的结核病实验室大多隶属于当地指定的结核病定点医疗机构，按照结核病防治服务体系总体设计基本是以行政区划为单位的，因我国各地人口、经济、结核病流行病学等差异较大，现有网络职能的功能性是否能够满足实际需求且使患者获得最优质诊断服务需要进行系统性评估，而目前尚缺少这方面的评估和证据。(-)诊断技术及流程WHO推荐的大部分产品在我国并未获得注册证书，但我国自主的检测技术近些年亦快速发展。目前在国家药品监督管理局注册和备案的用于MTB核酸检测的产品有20余种,主要分为实时荧光定量PCR扩增、等温扩增两大类技术，还包括基于RNA的分子生物学检测技术。耐药基因检测技术则有基因芯片、熔解曲线、斑点杂交、测序等。检测结核分枝杆菌潜伏感染的产品有EC-TeSt、TB-IGRA、IP-10、IL-2IGRA双因子检测等。我国在WS2882017肺结核诊断4行业标准中明确将分子生物学检测纳入病原学的检查方法，同时将免疫学检查方法如结核菌素皮肤试验、Y-干扰素释放试验、MTB抗体检查作为辅助检查的方法。在中国结核病防治工作技术指南（2021版）（简称指南）中亦明确了临床可应用的结核分枝杆菌潜伏感染检测技术、活动性结核病检测技术，以及耐药结核病检测技术。WS2882017肺结核诊断和指南与WHO发布的其他文件最大区别是我国将免疫学检测方法列为辅助检查手段，而WHO则不建议将结核菌素皮肤试验、Y-干扰素释放试验等用于中低收入国家活动性结核病的诊断，主要原因可能是我国病原学阳性率依旧较低,因此需要寻找更多的证据支持临床诊断。对于检测流程，我国指南中提出了3个耐药诊断流程，要求各地依据已经具备的耐药检测能力选择相应的检测流程。流程1为分子生物学核酸检测和传统表型药物敏感性检测技术相结合的流程，流程2为分子生物学耐药检测和传统表型药物敏感性检测技术相结合的流程，流程3为仅依赖传统药物敏感性检测技术的流程。相比于手册中的4个流程,我国的流程整合性更强（依据可获得的技术设计了3个流程），实际涵盖了从患者就诊直至判定为敏感结核病或各类耐药结核病的全流程。但7寸于异烟月井耐药利福平敏感的患者，手册单独设计了流程4详细描述该类患者后续检测，对于结核病合并HIV感染的检测，手册也专门设计了应用LF-LAM的流程2。对比我国指南中的检测流程，未对这两类人群的检测进行规定或建议。另外，手册中建议应开展诊断流程的评估，以评价和分析各流程对于患者和公共卫生的影响和效果。我国各地也可考虑开展针对不同检测流程及流程中涵盖的我国自主开发的不同的结核病及其耐药性检测产品的应用效果的系统性评估，同时结合耐药监测（联合利用分子生物学检测方法、表型药物敏感性试验、基因组测序方法等）评价其对于整个结核病防控的影响。（三）质量管理我国已开展较完善的室间质量评价活动（能力测试、现场督导、批量测试等），对于生物安全、具体检测技术的质量控制的要求和实施亦比较成熟。但对于保证质量的其他活动如人员能力评估、仪器验证和方法验证、质量指标监测及质量改进和系统化质量管理体系的实施等具体要求直到2021版指南出版后才明确提出。我们建立的全国结核病实验室网络星级评定体系即是对于质量管理体系在结核病实验室网络领域实施的具体实践，目前已建立配套的结核病实验室质量管理和生物安全建设指南全国结核病实验室星级评定实施方案全国结核病实验室星级评定现场评审清单，并且今年将会在部分试点实验室进行现场评审，但像手册中描述的一样，对于大部分基层实验室而言，全面实行质量管理体系是比较困难的，也提醒我们未来需要针对基层实验室建立最基本的质量保证要求，如至少涵盖本文质量保证中描述的9个关键活动，其次质量指标监测也需要纳入实验室的整体室间质量评价计划中。参考文献1WorldHeaIthOrganization.Globaltuberculosisreport2022.Geneva:WorldHealthOrganization,2022.2WorldHealthOrganization.Practicalmanualontuberculosislaboratorystrengthening(2022update)Geneva:WorldHealthOrganization,2022.3WorldHealthOrganization.WHOconsolidatedguidelinesontuberculosis:Module3:Diagnosis-TestsfortuberculosisinfectionGeneva:WorldHealthOrganization,2022.中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS288-2017肺结核诊断.2017-11-09.5赵雁林.中国结核病防治工作技术指南（2021版）.北京：人民卫生出版社，2021.