实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白.ppt

1,实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE),动物医学院动物生化教研室,2,掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理；学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；了解血清蛋白的主要成份。,一、实验目的,3,二、实验原理,不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。,4,Bis将单体长链连成网状结构,TEMED催化AP生成硫酸自由基,1、聚丙烯酰胺凝胶生成,催化Acr聚合成长链,Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸胺（催化剂）TEMED：N,N,N,N-四甲基乙二胺（加速剂）Acr、Bis决定孔径大小AP、TEMED决定聚合速度,5,连续胶电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。优点：制胶简单、快捷缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀缓冲系统组成简单，来源广泛缺点：分辨率不高,2、连续胶和不连续胶电泳,6,不连续胶电泳 采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。优点：分辨率高用于复杂和特殊样品的分离,7,不连续电泳的三种物理效应样品的浓缩效应凝胶的分子筛效应电荷效应,电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。,不连续电泳的四种不连续体系凝胶的不连续缓冲液成份的不连续缓冲液pH值的不连续电压梯度的不连续,8,三、实验步骤,封槽 清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上,9,分离胶：A:C:D:E1:2:3:2（V/V）浓缩胶：B:C:D:E2:1:5:2（V/V）A:pH8.9 Tris/Hcl缓冲液B:pH6.7 Tris/Hcl缓冲液C:30%Acr-Bis贮存液D:水E:过硫酸铵 灌装前加入TEMED，混匀,取干净玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分离胶至管口1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm处、封水；凝固后备用。,制胶和灌胶,10,加样 用微量注射器取样品液15l，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。电泳连接电极，上负下正；浓缩胶：3mA管，分离胶：4mA管；待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。剥胶,取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水冲洗几次。,11,染色 将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min，然后再浸入7%醋酸溶液中 脱色。血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。,12,分离胶和浓缩胶中A,B,C,D,E各是什么组分。分离胶和浓缩胶中缓冲液的组分，pH值异同？它们与电极缓冲液有区别？本实验有哪些不连续？为什么比醋酸纤维薄膜电泳分辨率高。,四、思考题,