2023液体活检在癌症筛查中的现状及展望（完整版）.docx

2023液体活检在癌症筛直中的现状及展望（完整版）摘要中国癌症发病率持续升高，但受限于当前检测技术等诸多因素，癌症筛查和诊断的灵敏度、特异度不够理想。随着液体活检技术的发展，癌症的早筛、早诊产生了诸多突破性进展。液体活检应用于肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等单癌种的筛查，具有侵入性小、快速便捷、可重复性强等优点，可实现癌症早发现、早诊断。液体活检还具有高特异度、高灵敏度、高性价比的特点，可以同时检测多种癌症，并提供准确的组织溯源结果，被认为是下一代癌症早筛技术的突破口。本文就液体活检在单癌种和多癌种领域的研究进展加以综述，并对未来癌症诊疗新格局进行了展望。正文癌症目前已成为我国居民的首要死亡原因，且其发病率和死亡率还在不断攀升。据国际癌症研究机构数据显示：我国2020年有约457万例新发癌症病例和300万例癌症死亡病例，分别占全球新发癌症病例的24%和癌症死亡病例的30%1o并且，我国癌症的整体5年生存率与美国相比有较大差距（40%比67%）2,3,主要原因是我国大部分癌症患者在确诊时已属中晚期，预后较差。以肺癌为例，低剂量螺旋CT（low-dosecomputedtomography,LDCT）的推广使美国肺癌高风险人群肺癌死亡率降低了20%,全因死亡率降低了6.7%4;也使我国高风险人群中肺癌的检出率提升了4倍左右（1.5%比0.3%）50由此可见，早筛、早诊、早治是提高癌症患者生存率的关键。从卫生经济学的角度来看，癌症早期发现可带来经济效益。广州市结直肠癌经济负担调查显示，不同分期结直肠癌患者的医疗费用水平差异存在统计学意义（P<0.001）:癌前病变的费用最低，IV期平均费用是I期的2.7倍6,癌症筛查可以提高早期患者比例，降低医疗费用。2020年，国家癌症中心对结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等6种常见癌症现有筛查方式的卫生经济性进行了系统评价，结果显示：以每挽救一个生命年的增量成本计算，食管癌筛查最为经济有效，其次分别为结直肠癌、胃癌和乳腺癌7o癌细胞在生长、坏死、凋亡的过程中，会释放一些癌症信号到体液（包括血液、尿液等）中，通过检测体液中的癌信号可以早期发现癌症。作为体外诊断的重要分支，液体活检还具有快速便捷且侵入性小等优点。随着液体活检技术的发展，癌症的早筛、早诊也产生了诸多突破性进展。本文主要就液体活检在癌症早筛、早诊技术的发展现状加以综述，并对未来癌症诊疗新格局进行展望。一、现有癌症早筛手段的局限性尽管早筛、早诊可以显著提高早期癌症检出率”制氐癌症相关死亡率；但受限于当前检测技术等诸多因素，目前大部分癌症没有推荐的筛查方法。美国癌症研究所只推荐对肺癌、结直肠癌、乳腺癌和宫颈癌进行筛查，获得推荐的筛查手段也只能做单一癌种筛查，灵敏度和特异度也不够理想。而且由于部分筛查方式存在侵入性、操作不便、有辐射性等问题,导致民众对于筛查的依从性很低。LDCT是肺癌常规筛查手段,美国肺癌筛查项目数据显示，LDCT筛查I/期肺癌的检出率约70%,但同时也带来了较高的假阳性率8L肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准,肠镜筛查可以降低56%的结直肠癌发病风险以及57%的死亡风险；但由于肠镜操作复杂（需要良好的肠道准备、完整的盲肠插镜率和足够的退镜时间），以及存在穿孔、出血等无法忽视的并发症，导致临床依从性很低9o中国医学科学院肿瘤医院2019年发起的一项研究显示，在结直肠癌高风险人群中，仅有约14%人群同意接受肠镜检查10L乳腺铝靶（X线）筛查乳腺癌在特异度96%时,灵敏度可达到80%o乳腺铝靶联合乳腺超声筛查可达到96.2%的灵敏度和92.6%的特异度11o我国乳腺癌易感人群接受X线筛查的比例约为50%12,而在欧盟国家，筛查率约为95%13,显著高于我国。中国乳腺癌筛查指南推荐的乳腺B超筛查,我国3569岁女性的筛查率仅为22.5%140此外，每年接受乳腺X线筛查可能存在诱发恶性肿瘤的风险，据估计，一生中乳腺X线辐射诱发恶性肿瘤导致的女性死亡率为16/10万150宫颈液基细胞学涂片筛查宫颈癌的性能优于巴氏涂片，但灵敏度依然较低,在特异度96.3%时,灵敏度仅为53.0%16o相比单癌种特殊的筛查手段，血清肿瘤标志物筛查是另一种广泛用于单癌种或多癌种筛查的手段。有文献报道癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen,CEA)在结肠癌中的灵敏度为40.5%,特异度为95.4%17;在胃癌中的灵敏度为19.8%,特异度为95%18o但CEA在肺癌、乳腺癌等肿瘤以及一些良性疾病中也有高表达19糖类抗原19.9(carbohydrateantigen19.9,CA19.9)在中国胃癌人群中灵敏度为10.3%,特异度为95%18;在胰腺癌中灵敏度为64%,特异度为99%20;其他如肝、肺部以及妇科等良性疾病中也可见CA19.9升高210综上可见，血清肿瘤标志物灵敏度及特异度均不高，常常在肿瘤进展到一定阶段才发生指标升高，且在部分良性病变中也同样会发现相似的变化,通过血清肿瘤标志物的单独升高无法提示肿瘤来源，因此无法作为临床常规筛查手段推广。总之，现有的癌症筛查手段比较匮乏，依赖于软件及硬件的支持，对广大基层医疗卫生机构的医疗资源和技术水平要求较高，民众接受度较低，花费较大，收益较小。基于以上国情，研发和推广具有更高效率、更高性能以及更经济的肿瘤早期筛查技术对我国的肿瘤防治工作具有重要意义。二、液体活检在不同癌种中的筛查进展近年来涌现出许多癌症早筛、早诊的方法，可以提前检出或者帮助鉴别诊断良恶性W瘤。液体活检作为体外诊断的重要分支，具有快速便捷且侵入性小等优点。常见的生物标志物包括循环肿瘤细胞(circulatingtumorcellzCTC1循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNAzCtDNA细胞游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA外泌体口循环肿瘤RNA等220CtDNA是基于对肿瘤相关驱动基因变异的检测,因而利用其进行肿瘤筛查可能具有较好的特异度22;但由于早期肿瘤患者突变负荷低，目前的检测技术难以检测到浓度极低的CtDNA含量，因此CtDNA的检测多用于局部晚期或远处转移的肿瘤22,230CtDNA某些区域的异常甲基化也可作为早期筛查的生物标志物。基因启动子区域的甲基化改变在癌症发生的早期阶段就会出现，甚至早于基因突变出现之前240在早期癌症中,相关的特异性甲基化位点众多,其改变有数量级上的优势24o除了DNA,外周血中包含多种RNA,其中微小RNA(microRNA,miRNA)在细胞生长、发育及疾病发展中起着十分重要的作用，血清中miRNA在肿瘤中会呈现特异表达22,但是单个miRNA作为生物标志物的预测效能不足，因此基于循环miRNA和外泌体miRNA进行多个标志物的建模以及标准化miRNA的分离和定量和用于数据分析的方法是目前探索的主要方向。(一)肺癌CfDNA可以在突变、甲基化和片段化三个层面为肺癌早期筛查提供信息。有研究表明利用CfDNA突变特征区分肺癌患者和高危人群,在98.0%的特异度下，I期灵敏度为41.0%67.0%250Liang等26通过筛选肺癌相关甲基化特征建立分类器，发现特异度为95.8%时，IAI期的灵敏度提高至51.6%81.4%.此外,Mathios等27开发了一种以全基因组技术来分析CfDNA片段化模式的方法一用于早期拦截片段的DNA评估(DNAevaluationoffragmentsforearlyinterception,DELFI);在肺癌诊断中，特异度为80%,灵敏度约为90%o然而,在早期肺癌特别是肺腺癌筛查中,CfDNA灵敏度低的问题仍需解决28o有研究证实了肿瘤自身抗体(autoantibody,AAB)嗅素结构域蛋白1在肺腺癌中的表达明显高于其他类型肺癌，并选择了6种AAB建立模型区分肺癌患者和健康人群，1期灵敏度和特异度分别为92.2%和85.7%,阳性预测值(positivepredictivevaluezPPV)和阴性预测值(negativepredictivevalue,NPV)分别为59.4%和97.5%28液体活检可以存在于LDCT的上游，与LDCT联合或存在于下游来完善肺癌筛查。如使用DELFI进行预筛查，通过LDCT进一步评估阳性受试者,可显著提高肺癌筛查的效能；PPV从单独使用LDCT筛查时的1.9%提高至3.9%并可减少不必要的后续辐射暴露和侵入性活检27oRen写29利用AAB分类器置于LDCT下游帮助区分LDCT难分辨的肺结节良恶性病变，诊断准确率由50.0%提高至89.1%。理论上，LDCT提供肺结节生长的宏观形态特征，而液体活检提供分子层面的微观信息，两者相辅相成,联合模式值得探究"旦值得注意的是，LDCT本身灵敏度较高,将液体活检置于其上游时仍需谨慎。(二)食管癌、胃癌、肠癌传统的血清蛋白标志物检测胃癌灵敏度较低，但联合血清蛋白酶原I/H胃泌素17、幽门螺旋杆菌抗体检测及受检者年龄和性别的评分方法可有效区分高危和低危人群(患病率12.3%比1.2%)30O此外，有研究者开发了针对食管腺癌癌前病变巴雷特食管的脱落细胞取样装置，在检测出细胞学阳性的患者中再进行内镜检查；在高危人群中，基于细胞学检测组的巴雷特食管检出率是常规诊疗组的10.6倍310液体活检也可作为内镜检查前的分层工具。一项纳入胃癌高危人群的前瞻性研究显示，血清12个miRNA组合的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为87.0%、68.4%、6.6%和99.5%;miRNA检测阳性者再进行内镜检查，减少了检出胃癌患者需要的内镜检查次数，进一步提高卫生经济学效益32o其他液体活检标志物如CfDNA甲基化33和血清外泌体长链非编码RNA18等在食管癌和胃癌的探索多为回顾性，结果仍需进一步验证。一般而言，结直肠癌的发生发展会历经漫长的癌前病变，识别进展期腺瘤并通过及时干预能降低肠癌发病率34o但现有筛查方式中肠镜的侵入性操作导致其依从性差10,免疫化学法粪便隐血试验(fecalimmunochemicaltestzFlT)和化学法粪便隐血试验(guaiac-basedfecaloccultbloodtest,gFOBT)等检测癌前病变的效能有限350美国食品药品监督管理局(foodanddrugadministration,FDA)批准的肠癌早筛产品COIC)guard0检测了粪便样本中突变、甲基化、蛋白及FIT,显示出优于FIT的灵敏度(92.3%73.8%),识别癌前病变的灵敏度相比Frr有所提急42.4%比23.8%),但整体特异度有所降假86.6%比94.9%)360除粪便样本外,液体活检也可用于结直肠癌的早筛，已有多项大样本前瞻性研究验证其效能。SEPT9甲基化位点是FDA批准的结直肠癌血液样本早筛标志物，灵敏度和特异度为48.2%和91.5%,PPV和NPV为5.2%和99.5%;但在早期肠癌及癌前病变的灵敏度较低，仅为11.2%370另一项研究从回顾性队列中筛选出一独立甲基化位点cg10673833,并在结直肠癌高危人群的前瞻性队列中验证了其效能，灵敏度和特异度为89.7%和86.8%,PPV和NPV为11.8%和99.8%;但同样发现其检出癌前病变的效能不足，灵敏度仅为33.3%38o相较于独立的甲基化位点，基于多靶点甲基化检测的机器学习模型在多项研究中展现出更高的灵敏度(83.6%87.9%)和相似的特异度(83.3%91.9%)38z39,40oM他结直肠癌血液标志物包括血清蛋白与多糖411血清miRNA42和CfDNA片段图谱43等，但尚缺乏前瞻性研究验证。总体来说，现有液体活检标志物在进行结直肠癌早筛中已取得较大突破，但在识别癌前病变方面尚待改善。(三)肝癌、胰腺癌美国国家综合癌症网络(nationalcomprehensivecancernetwork,NCCN)指南推荐肝癌发病风险升高的人群(如肝硬化、慢性乙肝等)每6个月进行一次超声检查,可同时进行甲胎蛋白(alphafetoproteinAFP)检测。然而超声检查在肝癌早期缺乏良好的灵敏度，仅凭AFP检测易造成漏诊和误诊440传统血清学检测还包括甲胎蛋白异质体3与异常凝血酶原等，但单独检测效能不足，需三项联合或结合B超44o多项泛癌种研究表明，与其他肿瘤相比，早期肝癌CfDNA释放入血信号最强，这使得CfDNA成为早期肝癌筛查潜在的理想选择45o2017年XU等46筛选出10个甲基化标志物建立肝癌的综合诊断模型，该模型可有效区分肝癌和健康人群,灵敏度为83.3%,特异度为90.5%,且诊断早期肝癌效能优于AFPo考虑到区分肝病患者对于肝癌早筛的重要性,Luo等47基于CfDNA甲基化标志物建立的模型可有效区分肝癌、肝硬化和健康人群，灵敏度为83.6%,特异度为96.0%,有助于实现肝癌高危人群的早预警、早诊断和早治疗。5-羟甲基胞口密咤与基因调控和肿瘤发病机制密切相关，通过将5-羟甲基胞口密咤与末端序列、片段分布和核小体印迹特征相结合构建的肝癌诊断模型，灵敏度和特异度分别为95.4%和98.0%,对于极早期和早期肝癌的筛查灵敏度相比AFP同期提升了3倍比异常凝血酶原提高了70%48o除了CfDNA,血清miRNA作为诊断肝脏疾病潜在的生物标志物一直很受关注,Zhou等49筛选出7个miRNA组合(miR-122、miR-192smiR-21xmiR-223xmiR-26axmiR-27a和miR-801),区分肝癌患者与健康人群的灵敏度达到83.2%,特异度为93.9%;基于此结果,团队自主研发了全球首个'7种微小核糖核酸肝癌检测试剂盒，并于2017年获得国家药品监督管理局的三类器械注册证和生产许可证。液体活检相关的标志物在肝癌早期筛查展现出了较好的灵敏度和特异度，但目前仍缺乏无症状高危人群前瞻性的数据。FDA于2021年4月授予BluestarGenomics公司无创胰腺癌早筛突破性医疗器械认定，该产品通过检测CfDNA上羟甲基胞口密咤的变化,用于在新发糖尿病患者中筛查胰腺癌50O除CfDNA外，Schultz等51发现联合不同的循环血miRNA构建检测模型,灵敏度可达85.0%,特异度达到64.3%85.4%。此外,循环外泌体在胰腺癌早筛中的潜在作用已成为另一研究热点。Yang等52鉴定了基于循环外泌体的蛋白标志物谱，包括EGFRxEpCAM.MUC-1、GPC-1和WNT2,检测胰腺癌的灵敏度和特异度分别为86.4%和81.0%,目前此种筛查方法的不足在于缺乏高特异度的鉴别方法将循环外泌体分离。除了血液，胰液和唾液等其他液体样本在胰腺癌的早筛中也发挥着重要作用53,54o（四）乳腺癌早期乳腺癌患者血浆CfDNA中可以检测到存在于组织中的突变55oZhang写55JS于靶向二代测序技术对乳腺癌患者血浆样本进行CtDNA突变检测，II期患者的检出率为69.2%76.7%.当与影像学检查结合后，整体灵敏度并未有显著提升，仅为74.2%o突变作为乳腺癌早筛标志物结果不够理想，部分原因可能来自于血液中CtDNA突变丰度低而导致的检测受限。而血液中CfDNA甲基化位点丰富，Liu等56基于全基因组亚硫酸盐测序技术，构建了基于CfDNA甲基化评分的早期乳腺癌诊断模型，能有效诊断早期乳腺癌，曲线下面积(areaundercurve,AUC)为0.81将模型与影像学检测结合后，诊断效能得到进一步提升(AUC=O.93),灵敏度和特异度分别为91.7%和88.0%o多个miRNA联合可以进一步提高模型诊断效能，Chan等57发现血清miR-1xmiR-92a.miR-133a和miR-133b分别具有较高的乳腺癌诊断效能(AUC=O.780.87),而其中两项结合建立的乳腺癌诊断模型AUC可提高到0.900.91.2021年11月分子肿瘤学机构DatarCanCerGenetiCS宣布FDA授予其基于血液CTC的检测产品突破性医疗器械认定,或可用于乳腺癌早筛。未来，液体活检多组学如何整合不同生物标志物的优势，与目前的标准护理模式结合进一步提升乳腺癌早筛的效能，值得深入探索。(五)妇科肿瘤高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是宫颈癌最主要的致病因素58o国际癌症研究机构专家认为HPV核酸检测是其首选的筛查方式59o目前还可基于外周血60和尿液61等样本对HPV的信使RNA或蛋白进行检测，且对宫颈癌以及子宫颈鳞状上皮内病变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)均有一定的检出率。CObas(S)HPV检测试剂盒是FDA批准的首个用于HPV一线初筛的产品，检出CIN3+的灵敏度达92.0%,高于液基细胞学检查的53.3%62o除THPV感染外,宫颈癌的发生还与关键基因突变(如PIK3CAxTP53和KRAS等)63及甲基化异常58密切相关，这些可作为潜在有效的宫颈癌或癌前病变筛查标志物。约翰霍普金斯大学癌症中心开发出一项针对卵巢癌和子宫内膜癌的筛查技术，该技术使用多重聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)联合检测常规巴氏涂片检查的宫颈液样本中18个基因的突变情况及染色体整倍数的变异情况，检出子宫内膜癌和卵巢癌的灵敏度分别为81%和33%,特异度约为99%o被检出的患者中有78%的子宫内膜癌患者和34%的卵巢癌患者处于癌症早期641针对BRCA1/2突变的卵巢癌高风险人群NCCN指南推荐在适当年龄进行预防性输卵管卵巢切除术；针对一般风险人群，尚无任何指南或专业机构推荐进行卵巢癌常规筛查65o有研究表明，采用靶向亚硫酸氢盐测序技术构建的3个DNA甲基化血清标志物组合可在临床诊断前两年检测到卵巢癌，灵敏度和特异度分别为57.9%和88.1%,筛查早期卵巢癌灵敏度优于糖类抗原125(carbohydrateantigen,CA125I57.9%比42.1%),但特异度较低(88.1%比95.5%)66L此夕卜，Kandimalla等67发现采用miRNA联合模型筛查卵巢癌优于单独使用CA125并在回顾性I期患者中AUC=0.96,总AUC=0.89)和前瞻性队列(AUC=0.92)中均得至IJ很好地验证。值得关注的是，获FDA批准的OVA1®早筛试剂盒基于CA125在内的5种术前血清标志物构建了卵巢恶性肿瘤风险评分，以此确定在术前需要转诊至妇科肿瘤专家的患者，但尚未有指南推荐作为卵巢癌筛查或独立诊断工具650(六)泌尿系统肿瘤肾细胞癌约占肾癌的80%,死亡率高，有50%60%的患者在确诊前无明显症状，目前临床上并无有效的筛查手段68,因此液体活检在肾细胞癌早筛中的探索越来越受到研究者们的关注。Nuzzo等69利用CfDNA甲基化免疫共沉淀测序准确地区分了肾细胞癌患者和无癌对照组(AUC=0.99为了证实CfDNA甲基化免疫共沉淀测序对尿液的作用，研究者对受试者的尿液CfDNA进行了相同方法的分析,平均AUC为0.86。膀胱癌的常见临床症状是肉眼血尿，部分患者仅表现为显微镜下血尿及刺激性苗E尿，临床上需要进行膀胱镜及必要的影像学检查确诊70O目前基于尿液和血液的生物标志物可以作为膀胱镜检查的有效补充手段。Chen等71基于两个尿液DNA甲基化位点建立并验证了区分膀胱癌患者的模型，灵敏度和特异度分别为90.0%和83.1%o该方法在灵敏度上同尿液细胞学和荧光原位杂交检测(fluorescenceinsituhybridization,FISH)方法相比得到大幅提高，特别在早期膀胱癌中，灵敏度为64.5%,而尿液细胞学和FISH检测方法仅为11.8%和15.8%o除了CfDNA,Shimizu等72发现了4个血液miRNA位点(miR-137、miR-124-2、miR-124-3和miR-9-3）可以较好地区分膀胱癌，灵敏度和特异度分别为82.0%和91.0%。前列腺癌筛查中国专家共识（2021年版）中建议对身体状况良好，且预期寿命10年以上的男性开展前列腺特异度抗原（prostate-specificantigen,PSA）筛查731PSA虽然降低了前列腺癌的死亡率，但是不能区分良性和低级别的肿瘤，会导致过度诊断7402015年，Grdnberg等75利用临床变量（年龄和前列腺活检X血浆蛋白浓度（PSA.游离PSAx人激肽释放酶2、B-微精蛋白和生长分化因子-15）以及源自单核苜酸多态性的多基因风险评分对前列腺癌进行筛查，该模型AUC显著优于单独使用PSA筛查（0.74比0.56）;且在高危受试者中,该方法比PSA降低了44%的良性疾病活检次数以及32%的总活检次数,并且不影响前列腺癌的检出率。另一方面，液体活检在前列腺癌筛查中的应用也在不断尝试商业化，一种基于尿液外泌体基因表达的检测方法开发用于鉴别高级别、低级别和良性前列腺癌，进一步改善了适用人群高级别前列腺癌的识别效能，减少了不必要的活检次数760（七）血液肿瘤血液肿瘤早期预后优于中晚期，如非霍奇金淋巴瘤I期患者5年生存率约90%,而IV期患者仅约60%77,同时，Li等78发现利用M蛋白筛查出的骨髓瘤患者预后优于症状驱动的患者（3年总生存率：76.9%比46.6%),以上均提示血液肿瘤早筛的必要性。2021年，Gupta等79设计了基于MYD88、TERT启动子、IDHI/2、H3F3A和BRAF突变的快速多重基因分型检测方法，帮助诊断和鉴别诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤和其他神经系统肿瘤，灵敏度为57.6%,特异度为100%。另外，多项研究发现循环miRNA可作为血液肿瘤诊断的潜在生物标志物80o2020年AnnOncol公布了一项基于CfDNA甲基化技术的泛癌种早筛的研究。在99.3%特异度下，I期淋巴瘤的灵敏度接近60%,UIV期均超过75%81o在另一项独立验证研究中，在99.5%特异度下,浆细胞肿瘤的灵敏度为72.3%82o基于回顾性研究的良好结果，GRAlL公司进一步启动了首个基于泛癌种早期检测的前瞻干预性研究，在准确检测出的29例癌症患者中，有12例为血液肿瘤患者，值得关注的是，I口期淋巴瘤的检出率更高83o针对血液肿瘤早筛技术的探索与开发是目前临床需要重视的问题，特别是在淋巴瘤和浆细胞肿瘤中，现有泛癌种的数据提示我们基于CfDNA甲基化建立早筛模型的可行性，但由于样本量有限且单癌种需要进一步考虑灵敏度和特异度的选择，因此还需要在更多的临床研究中获得验证。(A)其他癌种EB病毒相关标志物是目前临床应用最广泛的鼻咽癌筛查诊断标志物84o一项前瞻性研究利用血浆EB病毒DNA载量对鼻咽癌患者进行监测，最终发现的I期和口期患者占比达71%,显著优于历史队列，灵敏度和特异度分别为97.1%和98.6%,PPV和NPV分别为11.0%和100.0%850此外多项研究表明EB病毒编码的miR-BARTs有望成为鼻咽癌新的诊断标志物，但仍需大样本研究验证，并制定相应的判定标准84o目前，如何更精准地锁定发病高风险人群，提高筛查方法的PPV,是鼻咽癌二级预防亟待解决的问题。近期，中山大学肿瘤防治中心的研究团队提出的鼻咽癌发病风险预测综合模型联合现有的EB病毒抗体筛查，将PPV由原先的4.7%提高至43.2%,解决了现有筛查方法效能低而无法在人群大规模应用的瓶颈860睾丸生殖细胞肿瘤筛查常用的血清蛋白标志物AFP,人绒毛膜促性腺激素和乳酸脱氢酶诊断效能不理想，仅在26%47%的患者中出现升高,且特异度有限。多项研究表明，基于miRNA的生物标志物，特别是miR-371a-3p,检测效能明显优于传统血清蛋白标志物，诊断灵敏度、特异度和PPV均大于90%87o另一项研究同样表明血浆miR371表达对于预测活动性生殖细胞恶性肿瘤具有高特异度和高PPV(100%)z检测效能(AC=0.97)优于血清蛋白标志物(AUe=O.630.75)和CT(AUC=0.77)880因此，未来可考虑建立miRNA技术的国际化标准并引入miR371作为生殖细胞肿瘤筛查的分子标志物。颅内肿瘤的确诊主要依赖于侵入性手术获得的组织标本，非侵入性的诊断方式可避免不必要的手术风险和患者焦虑。Nassiri等89证实了血浆DNA甲基化信号可以很好地区分脑胶质瘤和其他卢页内肿瘤以及健康受试者（AUC=0.99）；同时，甲基化分类器在IDH突变型和野生型脑胶质瘤、低级别以及高级别脑胶质瘤中均展现了出色的诊断效能（AUC0.98由此可见，液体活检技术或可作为颅内肿瘤标准诊疗流程的补充，辅助诊断可能不需要手术干预或手术风险大于获益的人群，以减少侵入性诊断操作带来的损伤风险。另外，对于需要手术的肿瘤，术前辅助诊断的信息可帮助优化手术方案及安全性89o总之，液体活检的发展与探索将填补此类恶性程度高且目前没有推荐筛查方式癌症的空白，未来更多大规模前瞻性研究有望提高这类癌症的早期筛查效能，进一步改善患者预后、提高生存率。三、液体活检在多癌种筛查的进展NCCN指南推荐的筛查方式主要针对单癌种，且大部分癌种没有推荐的筛查方式，而多癌种筛查更符合民众需求。以吸烟为例，T立60岁有吸烟史的女性做四种癌症筛查（LDCTx肠镜、乳腺铝靶、宫颈液基细胞学涂片）的累计假阳性率可高达43%90,因此，同时做几个风险因素相关的单癌种筛查不但会造成较高的累计假阳性率，并且多次筛查也会加重经济负担。此外，现阶段早筛技术亟需在高度准确敏感的检测和大规模筛查之间取得平衡，相较于单癌种早筛技术，多癌种筛查技术可以同时检测多种癌症，并提供准确的组织溯源结果，以限制评估无症状患者的范围、成本和复杂性，被认为是下一代癌症早筛技术的突破口，受到科学界和产业界的广泛关注。多癌种研究的技术壁垒更高，理想的多癌种筛查技术需要同时满足以下几个条件:(1)高特异度，避免过度诊断和过度治疗，减少受检者不必要的精神焦虑和随访负担；(2)高灵敏度，降低漏检率，减少进展至晚期的患者人数；(3)组织溯源准确性，准确告知肿瘤发生的具体器官，精准指导后续的临床检查方案；(4)高性价比，使筛查的成本可以控制，便于大范围推广使用；(5)侵入性小，便于操作，从而能够提高民众筛查的依从性，易于推广。液体活检作为体外诊断的一个重要手段，具有快速便捷、侵入性小等优点，为多癌种筛查提供了极具潜力的途径22,91,92o肿瘤细胞通过坏死、凋亡、分泌等形式，向外周血释放cfDNA、miRNA、外泌体、CTC等信号，随着测序技术的发展，借助高灵敏度的高通量测序等技术，可以对血液中的这些肿瘤信号进行捕捉、检测93o而机器学习技术的引入，进一步提高了肿瘤信号检测的灵敏度26,821目前国内外多家研究机构正在开展基于血液液体活检检测技术的多癌种筛查的研究。Liu等94开展了一项前瞻性、多中心、病例对照、观察性的纵向随访研究，循环游离基因组图谱(circulatingcell-freegenomeatlas,CCGA),旨在开发并验证通过一管血实现多种癌症的早期检测（multi-cancerearlydetection,MCED）和组织溯源，CCGA在北美142个医疗中心共招募了15254例受试者（8584例癌症受试者,6670例非癌症受试者），分为三个子研究CCGA-1、CCGA-2和CCGA-3其中CCGA-1为原理发现阶段，纳入分析训练集样本1785例，验证集样本1015例，同时对三种不同的基因组测序方法进行了全面比较，结果显示全基因组重亚硫酸氢盐测序（wholegenomebisulfitesequencing,WGBS）检测CfDNA甲基化模式的性能，分别优于全基因组测序检测拷贝数变异和靶向测序检测单核甘酸变异/插入/缺失；在组织溯源上，甲基化优于另外两种方法学94o最终确定了基于CfDNA甲基化的多癌种筛查技术路线。CCGA-2为试剂研发和机器学习模型构建、初步验证阶段，纳入分析训练集样本3133例，验证集样本1354例，利用WGBS对血浆CfDNA进行分析,靶向位点组合涵盖了超过10万个信号丰富的甲基化区域。通过机器学习建立了多癌种筛查模型并进行初步验证，可以同时检测50种癌症，整体特异度为99.3%,灵敏度为54.9%,组织溯源准确性为93%81oCCGA-3为大规模的临床验证阶段，共纳入分析4077个样本，其中癌症患者2823例，非癌症人群1254例,主要目的是对模型进一步优化后在一个独立的验证集中进行验证，结果发现在超过50种癌症类型中检测到癌症信号的特异度为99.5%,总体灵敏度为51.5%,且灵敏度随分期升高（IIV期灵敏度分别为16.8%、40.4%、77.0%和90.1%1组织溯源预测真阳性的总体准确率为88.7%在12种预先指定的癌症（约占美国每年癌症死亡人数的2/3）中II期的灵敏度为67.6%;在肿瘤高危人群50-79岁的受试者中，研究团队预测了该模型的PPV和NPV分别为44.4%和99.4%82o这些结果支持了这种以血液为基础的MCED筛查作为现有单癌种筛查的补充的可能性，对整个行业具有重要参考意义,但CCGA系列研究也具有一定的局限性：如果在癌症患者进行活检后采集血液样本，与活检前相比，可能会增加血液中CfDNA的比例；另外CCGA是一项病例对照研究，可能不能完全反映该试验在人群筛查条件下的表现。在后续进行的前瞻干预性研究PATHFlNDER中为了评估该模型的效能，招募了来自美国7家临床机构的6662例50岁的受试者,并根据是否有吸烟史、肿瘤史、肿瘤家族史区分为高风险和一般风险组，进行MCED筛查，研究中期结果显示,该模型的PPV为44.6%,其中高风险组和一般风险组分别为57.1%和30.0%,模型预测首发或次发组织来源的准确性为96.3%,中位观测时间到确诊为50d83oPATHFINDER参与者的随访将继续进行，并将确定所有参与者在首次抽血后12个月内的癌症诊断发生率，届时将评估MCED测试的特异度和NPVo与CCGA的发现一致，在PATHFINDER的中期分析中，MCED测试可以在广泛的癌症类型中检测到癌症信号，且具有较高的安全性，这些结果支持了MCED在临床实施的可行性。CCGA系列研究主要基于CfDNA甲基化检测，其他技术类型以及基于液体活检的多组学研究也在纷纷开展。Cristiano等95基于CfDNA全基因组片段化谱，开发了一个人工智能平台DELFIz用以评估整个基因组中CfDNA的片段化模式，研究纳入6种癌症类型（乳腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和胆管癌），结果发现该模型识别癌症患者的灵敏度为82%,特异度为98%,组织溯源准确性为61%;此外，研究者将DELFI联合CfDNA突变做了进一步探索，在特异度98%的情况下，灵敏度提高至IJ91%o除此之外，Cohen等96开发了名为CancerSEEK的血液测试，研究纳入1817例受试者（1005例I期癌症患者；812例健康对照），将CfDNA突变检测与血清蛋白生物标志物结合起来，检测8种癌症（卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌）的整体特异度99%,整体灵敏度为70%,1期灵敏度为43%,组织溯源的准确性为63%;鉴于驱动基因突变通常不是组织特异的，绝大多数组织来源的信息来自血清蛋白标志物。该团队还曾开展过一项研究DETECT-A,这是全球首个万人泛癌早筛干预性前瞻性临床试验，研究对象为10006例未发现癌症的女性，年龄6575岁，评估基线检测CfDNA突变（16个基因）与蛋白标志物（9个）联合PET-CT成像检测用于癌症筛查的安全性和可行性；结果显示随访12个月，总计发现96例癌症患者，血液检测联合含PET-CT在内的影像学检查发现26例癌症患者特异度为99.6%,灵敏度为27.1%,PPV为40.6%,NPV为99.3%970这一结果提示在无症状人群中进行血液检测是可行的，可以作为常规癌症筛查手段的有效补充。但与CCGA的甲基化泛癌检测效能相比，突变联合蛋白的检测结果就稍逊一筹。考虑到不同种族间存在甲基化特征差异，在中国人群中，CfDNA的甲基化检测能否应用于泛癌种的早期检出以及组织溯源的准确性还需要进一步的临床研究验证。因此，在中国大规模群体中开展基于液体活检多组学的前瞻性、多中心的多癌种筛查研究意义重大。基于单链建库技术的CfDNA甲基化检测技术平台ELSA-seq,不仅可实现超低量DNA的稳定建库，并通过专利算法进行信息学多重降噪，通过机器学习精准捕捉肿瘤信号,在同一组样本中，比代表液体活检最高灵敏度的二代测序(next-generationsequencing,NGS)和微滴式数字PCR,灵敏度高出10倍以上260基于ELSA-seq甲基化检测平台,复旦大学附属中山医院开展了一项针对6癌种早筛的病例对照研究THUNDER,评估了基于CfDNA甲基化测序技术在多癌种筛查中的应用；该研究纳入1108例受试者(625例癌症受试者和483例非癌症受试者)，检测了国内6种高发癌症(肺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌和结直肠癌)，验证集模型的特异度为98.3%,灵敏度为80.6%,组织溯源的准确性为82%98Jo这项6癌种早筛研究,初步证实CfDNA甲基化检测在中国人群中作为泛癌种早筛的可行性。四、液体活检的局限性和发展展望随着各界对癌症早筛的关注逐渐升温，基于液体活检的癌症早筛相关技术的开发也取得了一定程度上的突破，不但使得一管血进行癌症精准早筛成为可能，而且使得一管血同时进行多癌种筛查成为可能。但是，目前液体活检所面临的挑战也不容忽视：(1)灵敏度、特异度等癌症早筛关键技术指标仍有待提升。CtDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段，但是由于在癌症早期，肿瘤CtDNA在血液中含量非常低，如何通过液体活检技术捕捉血液中含量极低的肿瘤信号成为技术开发的关键，针对本文提及的癌症早筛受到早期肿瘤信号相对较低限制的问题，目前认为通过超高深度的测序可以提高不同癌症类型检测的灵敏囿99,10Oz101,通过该方法检测限(limitofdetectionzLOD)可低至0.001%。此外，通过选择测序CtDNA片段的大小和基于单链建库也是提高CtDNA检测灵敏度的有效方法102J0(2)不同癌种早筛产品的核心评估指标应有所侧重。灵敏度和特异度是评估癌症早筛产品性能最重要的核心指标，灵敏度和特异度此消彼长，难以同时满足较高的水平。同时，不同类型肿瘤血液中CtDNA的浓度也有所不同，例如，肝癌、胆管癌、食管癌和卵巢癌释放入血的CtDNA信号较多，而前列腺癌和乳腺癌则可能释放入血信号较少45,这就导致针对不同癌种的早筛技术的灵敏度也应该有所不同。因此，需要在开发癌症早筛产品时同步考虑不同癌种的血液CtDNA浓度、惰性或侵袭程度和后续临床诊断路径，从而对灵敏度和特异度这两个指标进行综合评估，有所侧重，寻找最佳平衡点。例如对于后续有低伤害性临床确诊路径的癌种，提升灵敏度更为重要，为此可以容忍低特异度，目的是尽量减少漏诊；而对于后续没有成熟的临床确诊路径且相对惰性的癌种，则需要保证较高的特异度，为此可以容忍低灵敏度，目的是尽量减少误诊。(3)泛癌种早筛模型需要灵活的针对泛癌种和单癌种的混合模型。目前，癌症早筛产品既包括针对特定潜在高危人群的单癌种早筛产品，也包括针对一般