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2023单细胞RNA测序在糖尿病治疗中的应用(全文)摘要单细胞RNA测序技术(SinglecellRNAsequencing,SCRNA-Seq)从单个细胞水平分析细胞转录组，能够发现细胞中基因突变引起的差异表达。基于胰岛的发育图谱和异质性特征描绘是目前scRNA-seq在糖尿病中的主要应用；还可用于标记和纯化胰岛成体干细胞中功能性B细胞，有望改善1型糖尿病患者细胞移植成功率,该技术帮助研究糖尿病细胞去分化和免疫调节，应用于糖尿病治疗。同时，scRNA-seq在糖尿病性视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病动脉粥样硬化和糖尿病周围神经病变中运用已经起步，即将迎来多样化的使用场景和广阔的应用前景。单细胞RNA测序技术(Single-CeIlRNAsequencing,SCRNA-Seq)作为最近几年生物医学技术领域革命性发展的经典例子1在2018年被科学杂志评选为年度十大科学突破2,极大程度推动了精准医学和个性化治疗的发展，也是拆解糖尿病复杂性和异质性难题的重要研究工具。然而，由于该技术的高准入门槛和高昂的成本，它的应用一直被限制在一个狭窄的圈子里。最近23年，越来越多的商业化单细胞测序平台陆续走向市场，激烈的市场竞争带来各种技术创新、技术瓶颈的突破以及成本的大幅度降低3,4,5,尤其是在新型冠状病毒感染大流行之后，scRNA-seq被广泛用于研究免疫细胞对新型冠状病毒的反应。糖尿病是在遗传易感因素基础上由环境因素共同催生形成的一种复杂性和异质性疾病。糖尿病往往累及心脑血管、肝脏、肌肉和脂肪等多脏器的代谢性损伤，最终衍生出各种慢性致命性并发症。在糖尿病研究领域，scRNA-seq技术的应用相对来说还十分稀缺，目前主要集中在描绘胰岛细胞的不同分型和异质性特征，分析胰岛细胞的分化成熟过程和特征性标记物，研究糖尿病B细胞去分化和免疫调节，以及在糖尿病性视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病动脉粥样硬化和糖尿病周围神经病变中的少量应用案例。本文主要阐述scRNA-seq技术在糖尿病中的应用,该技术有望从基础研究向临床应用发展，指导糖尿病的诊断及精准治疗。一、SCRNA-Seq技术1 .scRNA-seq概述：单细胞测序技术是将通过分离实验得到的单个细胞，对基因组、转录组或表观组进行的高通量测序技术，从而获得单个细胞的遗传信息和基因表达的信息。过程主要分为单细胞分离、对所得单细胞全基因组扩增、高通量测序1,2。从测序对象的角度可分为单细胞基因组测序、单细胞转录组测序、单细胞表观组测序以及单细胞多组学测序7等。此外，单细胞多组学测序还可以和蛋白质组学、代谢组学等进行联合分析。常用的单细胞捕获方法主要有：有限稀释法、单细胞显微操作、流式细胞仪分选、激光捕获显微切割、蜂窝板技术和液滴微流控技术等8。在过去的10年里，单细胞转录组学取得了巨大的技术突破。scRNA-seq又被称为单细胞转录组测序，通过scRNA-seq,可以在单个研究中分析数百万细胞的单细胞转录水平，从而能够在转录水平上对每个细胞进行分类，识别出具有重要功能的稀有细胞群。scRNA-seq的程序主要包括单细胞分离和捕获、细胞裂解、逆转录、CDNA扩增和文库制备，与传统转录组测序分析技术相比，其差异分辨率明显提高。单细胞捕获、逆转录和CDNA扩增是文库制备步骤中最具挑战性的部分。单细胞分离和捕获是指从组织中获取高质量的单个细胞，然后提取细胞中的遗传和生化信息，促进遗传和分子机制的研究9。传统的转录组只能捕获组织信号的总体水平，无法区分单个细胞的变异。根据生物体、组织或细胞特性的不同，单细胞分离和捕获方法也不同，细胞分离可以通过分离整个细胞、细胞特异性细胞核或细胞特异性细胞器来完成，甚至可以通过分离表达特定标记蛋白的所需细胞来完成口0o最常见的单细胞分离和捕获技术包括限制稀释、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选、微流体系统和激光显微解剖。2 .scRNA-seq应用及平台：目前scRNA-seq有3个广泛应用的分支：单细胞免疫组库测序、空间转录组测序以及单细胞核转录组测序(SnRNA-seq)。单细胞免疫组库测序又称单细胞V(D)J测序,是以T/B淋巴细胞为研究目标,扩增T/B细胞受体(TCR/BCR)的基因转录子全序列后进行高通量测序11。空间转录组测序是将基因表达情况与组织切片定位染色图像进行整合，从而将组织内细胞的基因表达信息定位到组织的原始空间位置上,直接观测组织中不同部位功能区基因表达的差异12。SnRNA-Seq是指通过提取、分离、笔记样本单细胞核，在单细胞水平研究核基因表达的检测技术，是解决细胞类型少以及珍贵临床冰冻样本的重要方法。随着生命科学研究进入了单细胞生物学时代，商业化的scRNA-seq平台应运而生，单细胞测序技术的市场更是以年均20%以上的速度逐年增长。其中包括基于微流控芯片技术的FluidigmC1平台和ICELL8平台，起源自Drop-Seq技术的IOXGenOmiCS平台，源于Cyto-seq蜂窝板技术的BDRh叩SOdy平台，基于组合标签法的ICB-SCSeq平台等等口3,14。以目前占全球95%市场份额的IoXGenOmiCS平台为例，由于这种单细胞检测平台的商业化推广和运作，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低,不仅实现了细胞通量的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本15。二、scRNA-seq在糖尿病研究中的应用1.scRNA-seq在描绘胰岛图谱中的应用：胰岛细胞的异质性阻碍了对控制胰岛功能的每种胰岛细胞类型的精确理解，了解胰岛细胞的构成和功能,尤其是含量较少的讲口榭胞,以及其他罕见胰腺细胞的功能，可能是理解糖尿病病理生理学的关键16。美国杰克森实验室利用scRNA-seq技术解析了构成胰岛的细胞种类17,利用基于标记基因表达的细胞分类方法从2型糖尿病(T2DM)患者和正常健康对照人群的胰岛中鉴定出617个有效的单细胞(63%),包含了239个(GCG)细胞,264个(INS)细胞，25个(SST)细胞和18个PP(PPY)细胞J个罕见的E(GHRL)细胞，另外还有19个星状(COLlAl)细胞，24个腺泡(PRSSl)细胞和27个导管(KRTI9)细胞，可能来自胰岛细胞制剂的外分泌污染，以及21个细胞不表达任何特定标记基因。每种细胞类型的比例符合先前报道的范围18。胰岛细胞的scRNA-seq表明，胰腺导管细胞可被作为成体Ngn3+细胞的来源,导管细胞可以通过Ngn3表达成为内分泌细胞。Ngn3是胰腺内分泌祖细胞发育时表达的关键转录因子，与成人细胞新生发育密切相关，表达Ngn3的导管细胞是糖尿病成体细胞新生的来源，可支持B细胞再生。利用这种生理细胞来源，可有益于糖尿病患者的治疗19o该研究还揭示了幽3胞富集多种特异性表达受体(LEPR、GHSRxERBB4、DRD2),这些受体接收并协调来自瘦素、胃饥饿素和多巴胺通路的系统信号，提示驿胞是这些中央及外周代谢信号进入胰岛的集中调节器。8田胞还表达一种基因BCHE,乙酰胆碱和生长素释放肽能够被BCHE基因编码的酶所降解，可局部抑制胰岛的内分泌信号，从而影响胰岛素的分泌20。此外，该研究还在上田胞和榭胞鉴定到了一些以前被认为仅在细胞或者谣胞中表达的基因，如%田胞中的先天性高胰岛素血症基因HADH21和搦胞中的胰岛素富集转录因子ARX转录因子22。HADH基因编码的关键酶短链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶在脂肪酸调节胰岛素分泌中发挥关键作用，HADH是胰岛素分泌的负调节因子，在胰腺B细胞中含量丰富,并抑制谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性，HADH突变导致GDH和高胰岛素血症的激活23。ARX是胰岛素富集转录因子(TFS),其表达的变化与发育状态和糖尿病有关，在胰岛细胞发育和疾病中发挥作用，有研究表明在1型糖尿病中(TlDM)ARX表达下降，这表明该转录因子可能与TlDM中观察到的胰升糖素分泌受损有关24。研究还发现搦胞和5-羟色胺能神经元在基因表达方面存在平行现象,如V田胞表达一种5-羟色胺能转录因子FEV25,转录因子FEV是血清素能回路的调节因子，在血清素能神经元发育和功能中不可或缺，对许多生理状态和行为有广泛的神经调节作用，在发育或成年期，Fev的失活会导致5-羟色胺能神经元的耗竭，影响焦虑、情绪、睡眠和饱腹感26。2.scRNA-seq在胰岛分化和发育中的应用：T1DM的治愈在于细胞的恢复，scRNA-seq技术可以更好解释糖尿病B细胞发育和病理，了解健康和疾病中的细胞异质性。加州大学的研究者利用scRNA-seq技术对出生后1个月内5个不同时间点小鼠的胰岛细胞进行测序分析，得到了转录组的连续动态变化，发现具有分裂能力的未成熟的胰岛佟田胞有Srf/Jun/Fos转录因子的高表达和高度活跃的氨基酸和线粒体代谢特性27,从而揭示了不同增殖状态下单个细胞的特征，以及如何让B细胞进入到分裂状态的机制，为刺激胰岛B细胞的再生提供新的治疗靶点。止匕外，scRNA-seq描述了胰腺发育过程中控制胰腺轿口或田胞生成和成熟的机制，面邛细胞的增殖速率在不同的发育时间达到高峰，而调控发育的通路也在成熟过程中不断丰富。在来自幼体和T2DM供体的胰岛中，scRNA-seq分析出谣胞和细胞均具有不成熟的表达谱，或田胞与间充质细胞保持有限的转录相似性，保留了未成熟状态的特征，在成年期可具有一定程度的细胞可塑性,而佟田胞则获得了完整的佟田胞特异性基因表达程序,以田胞和B细胞可通过抑制非内分泌基因而部分成熟，而不成熟的表达谱可降低外分泌基因的表达，并增加了炎症和应激反应通路的表达28o但是，在不同物种之间面叩细胞有多个基因的差异表达，小鼠的胚胎胰岛细胞大多是单激素的,而大部分人类胰岛细胞最初是多激素的29。因此，可利用人类多能细胞在体外模拟人类胰腺的发育，同时使用scRNA-seq技术分析人类胰岛分化和发育,或可找到糖尿病患者中不同的表达特征。3.scRNA-seq在B细胞移植和胰岛类器官中的应用：T1DM是因人体的免疫系统错误地攻击并破坏了胰腺的细胞引起的，再生医学手段希望通过恢复体内功能性细胞的数量与质量，从而最终取代目前的胰岛素替代疗法。在人类胰岛移植时，可供研究的组织是有限的，与组织分离和单个细胞分离相比，snRNA-seq可快速分离细胞核从而使分离过程中转录组的变化降至最低，为移植研究提供了技术支持30。哈佛大学干细胞研究团队利用scRNA-seq技术分析胰岛中的细胞类型,并且发现了一种仅在B细胞上表达的表面标记物CD49a(ITGA1),并以此特异性地富集细胞,成功将转化干细胞样品中B细胞的分选纯度从30%提高到80%,首次实现了干细胞转化为功能性B细胞，为患者提供了自己的胰岛素来源31。此外，利用SCRNA-Seq技术在小鼠胰岛中发现存在一群以前未被识别的胰腺蛋白C受体阳性(Procr+)细胞群，Procr+细胞是胰岛中的成体干细胞，在体外3D培养体系下可以稳定地形成胰岛类器官，并在成年期产生所有内分泌细胞类型，在功能、形态、超微结构及转录组方面都与真正的小鼠胰岛表现出很大的相似性，能迅速响应葡萄糖刺激，分泌胰岛素，并且能在体外培养传代20代以上。将Procr+细胞群体外培养的胰岛类器官移植到糖尿病小鼠模型体内，可以改善小鼠的血糖水平，逆转糖尿病过程32。单细胞测序分析出的人胰岛细胞成熟和表达过程或可为人类发育中的胰岛细胞成熟分子程序和转录组成熟度丧失提供新的解释，并可推动胰岛细胞的分化发育研究和体外功能性胰岛类器官的研究。4.scRNA-seq在糖尿病去分化诱导治疗的应用：细胞分化不是单向的，在特定条件下，成熟的细胞会在不同程度上失去其分化表型和细胞特性，并退化到分化较低甚至类似前体的状态。有研究表明高血糖诱导的炎症会触发T2DM和T1DM的内分泌细胞去分化33。T2DM怀耶肽的基因表达模式类似于未成熟的细胞，这表明内分泌细胞受损触发去分化34。此外，将来自健康发育小鼠的未成熟或成熟B细胞的转录组与小鼠链眼霉素诱导糖尿病(mSTZ)模型中存活的佟田胞的转录组进行比较，发现mSTZB细胞逆转为胚胎未成熟供田胞样状态35。去分化可能与表观遗传机制有关，基于小鼠ScRNA-Seq分析发现，多梳阻滞剂复合体(PRC2)功能的缺失是成年B细胞功能丧失的潜在原因，T2DM胰岛存在PRC2功能障碍。在PRC2功能丧失的高脂肪饮食喂养小鼠中，佟田胞PRC2的失调触发了细胞基因组特定位点的表观遗传重塑,导致二价位点的异位表达和B细胞特异性转录因子乙酰化的显式缺失36o在人类新生儿中也观察到了未成熟细胞特征的双价位点重新激活34。scRNA-Seq研究结果显示应激激活B-细胞去分化引起的糖尿病可能通过抑制F0X01信号通路而得到加强37,FOX01抑制剂处理的小鼠和人胰岛B细胞去分化与海胞去分化相似38,同时,FOX01抑制也会导致巡胞去分化到一定程度。而聚乙二醇化胰岛素和胰高糖素样肽雌激素结合物联合治疗，主要通过诱导去分化B细胞的增殖和再分化来逆转mSTZ诱导的糖尿病，其中F0X01通路也参与这一过程，这提示B-细胞再分化是治疗糖尿病的一种有效策略35。5.scRNA-seq在糖尿病免疫调节的应用：T1DM是由于自身免疫破坏胰腺中表达胰岛素的细胞而导致的高血糖，T1DM的病理表现为胰岛炎症性淋巴细胞浸润，而CD8÷T细胞是重要组成部分39。自身免疫性T细胞可破坏B细胞，因此免疫细胞的调节至关重要，可以保护胰腺细胞质量和功能，防止免疫反应。通过scRNA-seq技术分析发现胰腺C(和细胞中存在一种细胞黏附分子I(CADMl),CADM1是一种含免疫球蛋白结构域的膜蛋白,介导同型和异型细胞与其他CADM家族成员的细胞间接触，并在整个胰岛表达40。CADM1可直接被B细胞中的miRNA375靶向，而miR-375是胰腺供田胞中最丰富的miRNA,miR-375可限制CADM1在细胞中表达，从而减少免疫细胞浸润。与非糖尿病患者相比,T1DM患者和自身抗体阳性患者的胰腺切片中,CD8÷T细胞附近的CADM1+胰岛内分泌细胞和髓系细胞数量增加，CADM1可激活免疫细胞，并在巨噬细胞和树突状细胞中表达增高41。这表明在自身免疫性糖尿病发病过程中,CADM1介导的细胞-细胞接触可能促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润。在自身免疫性糖尿病发展过程中，巨噬细胞的逐步激活程序,导致巨噬细胞亚群的极化。巨噬细胞中CADM1的富集促进淋巴细胞的招募,CADM1+细胞会通过免疫细胞中存在的受体I类限制性T细胞相关分子(Crtam)与CD8+T细胞和NK细胞结合42。Crtam是一种免疫球蛋白样细胞表面蛋白，Crtam-CADMI相互作用可增强NK细胞和CD8÷T细胞效应功能43。因此，药物抑制CADM1的功能可以促进细胞的分泌和生长，阻断CADM1介导的细胞间结合以防止B细胞破坏和T1DM的发生。6.scRNA-seq在糖尿病相关易感基因的应用：T2DM是一种非胰岛素依赖型糖尿病，是由遗传因素和环境因素共同作用引起的多基因遗传性复杂病，其中遗传因素对T2DM的影响已逐渐确定,Gas6基因rs8191974和Ap3s2基因rs2028299与T2DM相关44。研究人员通过scRNA-seq高通量测序研究非编码RNA(IncRNAxCirCRNA、miRNA)和mRNA的差异表达,并建立了竞争性内源性RNA(CeRNA)调控网络、InCRNA-CirCRNA-miRNA-mRNA网络和蛋白-蛋白相互作用(PPl)网络，发现IncRNAs.circRNAs.miRNAs和mRNA的表达谱存在明显差异，这在糖尿病的发生发展中发挥了重要作用45。LnCRNA-MlAT参与多种疾病发生，尤其是心肌梗死、糖尿病视网膜病变等微血管并发症，而T2DM患者IncRNA-MIAT的表达明显增高46,因此可以推测IncRNA-MIAT促进了T2DM的发生发展。LncRNAp3134在胰腺B细胞中与葡萄糖代谢和胰岛素信号转导有关，IncRNA-NEATI与miR-181b的结合促进mTOR信号转导,而mTOR信号通路和溶酶体通路与T2DM密切相关，胰岛素可通过诱导TSC1-TSC2TBC1D7复合体(TSC复合体)和溶酶体的分离来激活mTORC1,mTORC1过度激活会导致胰岛素抵抗47,相反，mTORC1活性降低导致低胰岛素血症。有研究人员从供体中提取人诱导多能细胞(iPSCs),在体外将其分化为样细胞，并进行scRNA-seq分析发现：错误折叠的胰岛素原可引起内质网应激，内质网应激的增加也导致mTORC1信号通路的减少和线粒体的改变，这对供田胞的增殖和功能至关重要，因此如果对mTORC1进行刺激，将为胰岛素相关的突变型糖尿病的治疗提供一个新的视角48o此外，胰腺B细胞凋亡是T2DM常见的病理特征，胰岛素抵抗是T2DM的主要发病机制。在糖尿病早期，B细胞可通过增加胰岛素分泌来克服胰岛素作用的缺乏，但是如果此时B细胞功能恶化，出现高血糖，则细胞无法代偿，出现胰岛素抵抗，胰岛素抵抗可导致糖毒性，继而加速细胞凋亡,并导致B细胞死亡49。利用高通量测序构建PPI网络并筛选了15个枢纽mRNA,发现AKT2、PIK3R5和CLTA是重要通路中富集的mRNA50zAKT2和PIK3R5主要富集于mTOR信号通路和凋亡通路,而CLTA主要富集于溶酶体途径,PIK3R5还可作为妊娠期糖尿病临床生物标志物51。因此通过scRNA-seq研究InCRNA和CircRNA差异表达并构建CeRNA网络，可探讨InCRNA和CircRNA在T2DM中的分子机制，为我们研究T2DM提供了一个新的方法。而基于scRNA-seq数据开发的RePACT算法，可以高灵敏度地识别相关疾病基因，识别T2DM不同细胞的变化，并进一步确定来自佟田胞特异性基因。其中1368个与细胞相关的T2DM基因位点被证实52。例如，GAPDHxSPP1和IAPP在T2DM患者中均下调。GAPDH是参与糖代谢和糖酵解的重要酶,SPP1和IAPP通常被认为是糖尿病的危险因素，IAPP形成的淀粉样蛋白与T2DM特异性细胞毒性有关53,SPP1介导肥胖诱导的巨噬细胞向脂肪组织浸润及引起胰岛素抵抗。此外章化应激被认为是影响T2DM患者胰岛素表达的关键因素。BAX-、CAPN1-、CAPN2-和TNFR1依赖通路可能是治疗T2DM细胞凋亡的有效靶点54。7.scRNA-seq与遗传学及电生理测量的联用：单细胞表观基因组学技术在解释复杂疾病遗传学方面也有很大的优势。加州大学Gaulton团队利用单细胞染色质可及性单核测序分析方法(SnATAC-Seq)分别与TIDM55和T2DM56的全基因组关联研究进行技术联用，建立了可识别胰岛细胞类型和状态特定的糖尿病风险调控基序。对520580个T1DM样本进行的全基因组关联研究，并结合131554个细胞核的转座酶的snATAC-seq发现T1DM的风险变异富集在T细胞和其他细胞类型中活跃的候选顺式调节元件(CCRES),多个TlDM信号的风险变异与外分泌特异性cCREs重叠,后者与具有外分泌特异性表达的基因相关，这些发现支持外分泌胰腺在TWM发病机制中的作用55。对15298个T2DM胰岛细胞和228873个染色质可及性位点进行的snATAC-seq发现位于KCNQ1位点的变异位点rs231361对胰岛素与细胞增强子的相互作用具有预测功能，并且对胚胎干细胞衍生的细胞进行基因编辑可以显著影响胰岛素水平56。此外，新单细胞测序组学技术(PatCh-Seq)将SCRNA-Seq与胞吐作用和通道活性的电生理测量联合起来，可在单细胞水平下研究相关内分泌生理和转录组状态，并通过基因网络和功能分析出一个与细胞功能异质性相关的基因集，这个基因集可以用来预测电生理学，单细胞技术和电生理学的联合使研究细胞生理功能变得精细化，可直接研究胰岛细胞的生理功能紊乱和基因表达改变两者之间的关系，并且揭示了单细胞转录组与人类胰岛失调的关联57。三、scRNA-seq在糖尿病并发症中的应用1 .scRNA-seq在糖尿病视网膜病变中的应用：糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是慢性进行性糖尿病导致的视网膜微血管渗漏和阻塞从而引起一系列的眼底病变，糖尿病视网膜病变包括神经退行性病变和神经炎症性病变，其中胶质、神经元和内皮功能障碍是疾病发展的关键。通过scRNA-seq研究糖尿病视网膜病变Akimba小鼠模型中神经元、胶质细胞和炎症细胞的转录特性,发现大胶质细胞在视网膜神经退行性病变中起关键作用58,由于代谢障碍影响其支持功能，细胞表型的异质性包括促炎和促纤维化群体，引起免疫系统通路的激活。利用scRNA-seq技术可识别配体-受体在不同细胞间的表达模式，建立视网膜的相互作用体，从而研究DR视网膜单细胞转录组图谱59。结果表明高血糖诱导小胶质细胞内肿瘤坏死因子(TNF)-白细胞介素18等促炎因子显著高表达，小胶质细胞的活化是由TNF-懵自分泌促炎因子介导的，小胶质细胞与血管内皮细胞沟通，通过分泌炎症因子打破血视网膜屏障，而视网膜细胞通过分泌抗炎因子转化生长因子(TGF)-2抑制小胶质细胞的过度激活60,因此，阻断TNF-可显著减少糖尿病引起的血管改变。此外，研究人员对取样自T2DM模型小鼠的视网膜组织进行scRNA-seq,推测出DR的治疗靶点是RLBP1基因，在穆勒胶质细胞(MG)中过度表达RLBP1基因能够缓解DR相关的神经血管变性61z这在基因水平上为研究糖尿病视网膜病变的治疗提供新的见解。2 .scRNA-seq在糖尿病肾病中的应用：糖尿病肾病是由于长时间患糖尿病而导致的蛋白尿以及肾小球滤过率(GFR)进行性降低，糖尿病肾病是糖尿病患者最重要的并发症之一。研究者对冷冻保存的人糖尿病肾样品进行了无偏性snRNA-seq,从3个早期糖尿病性肾病样品和3个对照样本中共检测到23980个单核转录组。通过识别肾皮质中的所有主要细胞类型，发现糖尿病患者肾小球中白细胞数量增加，导致肾脏的免疫性损伤62。其中，高表达的巨噬细胞标记物表明导致免疫性损伤的细胞主要是巨噬细胞。在巨噬细胞的表型标记中，M1表型标记的细胞数量高于M2表型标记的细胞数量，M1表型的巨噬细胞在糖尿病肾病损伤中更为突出63。通过研究糖尿病肾小球中的基因表达变化，在肾小球系膜细胞、内皮细胞和足细胞中发现了差异表达的基因，差异表达基因包括细胞外基质成分(COL4A1)、葡萄糖转运蛋白(GLUT3)和血管生成调节蛋白(VEGFC、VCAM.NR4A1、MYH9、ITGB1、PRCP.TMEM204sHDAC9、MEF2C)64o比较特定细胞类型的基因表达，发现促血管生成基因的上调影响细胞运动和细胞骨架重排，足细胞、内皮细胞和系膜细胞均具有血管生成表达特征。原发性膜性肾病中自身抗体的靶点PLA2R1和THSD7A在糖尿病足细胞中增加，系膜细胞中细胞外基质成分(COL4A1,COL4A2)和调控基因(MYH9,NR4A1zSLIT3zADAMTS12)表达增加驱动血管生成65。编码富含亮氨酸的82-糖蛋白I(LRGI)是一种新的血管生成因子，在糖尿病肾小球内皮细胞中表达增加，LRG1通过增强内皮TGF-B/激活素受体样激酶I(ALKl)信号转导来促进血管生成，是糖尿病肾病进展的危险因素66。此外，糖尿病会通过诱导基因表达的改变调节离子分泌，包括Na+/K+-泵、WNK1、NEDD4L和盐皮质激素受体表达，以及细胞旁路钙和镁的重吸收降低，从而诱发远曲小管上皮细胞的适应性改变，促进钾的分泌。因此，减少WNKl和NEDD4L的表达，并增加钙敏感受体(CASR)及其下游效应物CLDN16的表达,可减少的细胞旁路钙和镁重吸收，从而降低糖尿病肾病患者高血钾的发生率67o3 .scRNA-seq在糖尿病动脉粥样硬化中的应用：动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。动脉粥样硬化发展的关键步骤是内皮细胞(EC)功能障碍，并在糖尿病并发时加重。心脏作为循环系统的泵,有多种ECs包括心内膜ECs.主动脉特异性ECS和冠状血管ECso通过scRNA-seq技术发现，CytH和Npr3是心内膜ECS的标记物,Fabp4和Cd36是冠状血管ECs的标记物，Edh3和Fam167b在主动脉特异性ECs中表达68。在心脏发育过程中，心内膜中的某些ECs经历了内皮-间充质转化(EndMT)的过程，因此产生了间充质细胞，这在心内膜垫的形成中起着关键作用69。但是，EndMT来源的成纤维细胞样细胞在动脉粥样硬化发生发展中具有重要功能，使用内皮系示踪系统进一步证实，EndMT来源的成纤维细胞样细胞在动脉粥样硬化过程中引起生物功能增强，可调节细胞外基质组织及细胞凋亡70。而心肌梗死区域的EndMT是一个可逆的过程，通过抑制TGF-B信号可以减少这些细胞的扩张71,成为动脉粥样硬化的治疗手段。同时,在动脉粥样硬化发生发展中，促炎细胞因子导致内皮细胞的糖酵解增强，而糖酵解的增强又能驱动炎症发生，引起恶性循环，导致内皮细胞中持续的炎症信号转导72。此外，在动脉粥样硬化发生间质转化的EC中脂肪酸氧化(FAO)减少，scRNA-seq数据也显示了内皮细胞中的EndMT伴随着对FAO的抑制，这表明内皮组织FAO可能是EndMT过程的关键调控因子73,为糖尿病动脉粥样硬化诊断及治疗提供新的参考。4 .scRNA-seq在糖尿病周围神经病变中的应用：糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病并发症之一，DPN的特征是疼痛、刺痛、麻木和痛觉过敏，并伴有典型的手套袜套模式。研究表明，高血糖、胰岛素抵抗、内皮损伤和微血管功能障碍促进DPN的发生，而外周神经系统的施万细胞(SCS)在DPN的发病机制中发挥重要作用74。在糖尿病神经病变中，SCs激活了一些关键的信号通路，如高血糖诱导晚期糖基化终末产物(AGE)过量形成，AGE-RAGE信号通路的激活导致持续氧化应激和炎症75,SCs中表达AGE受体(RAGE),AGEs和RAGE之间的相互作用诱导糖尿病状态下周围神经的轴突脱髓鞘和退行性变，从而导致周围神经结构和功能改变76。通过RNA-seq或微阵列构建的各种转录组分析SCs中差异表达的mRNA、InCRNA和miRNAs发现miRNAs及IncRNAs是DPN中SCs病理生理过程中的关键介质。miRNAs通过与30个非翻译区(UTR)结合,抑制靶细胞中mRNA的翻译或降解，负向调节基因转录后的表达水平77,miR-146a和miR-25是DPN的发病机制中的关键调控因子78。InCRNAS通过转录后调控水平与miRNA相互作用，构建复杂的调控网络，脊神经节lncRNA-NONRATT021972的上调导致2型糖尿病的糖尿病神经痛79。这些差异表达的RNA可能是诊断和治疗DPN的潜在靶点。四、展望scRNA-seq是一项革命性的技术，其优势在于利用高分辨率研究糖尿病生物学在整个综述中,我们加深了对糖尿病及其治疗的理解。scRNA-seq的迅速发展揭示了基因和转录水平上的糖尿病发生机制和胰岛的内分泌信号通路，帮助分析胰岛细胞发育和分化成熟过程，并能应用于糖尿病去分化治疗及免疫调控。止匕外，在糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病中，scRNA-seq通过研究视网膜和肾脏中细胞的转录变化,发现了特定基因的表达改变，同时，scRNA-seq找到了糖尿病动脉粥样硬化中EndMT过程的关键调控因子。但是，scRNA-seq存在局限性，由于单细胞和单核悬液都必须从组织中制备，因此会导致组织学信息的丢失，同时与组织消化、细胞分离和保存相关的其他混杂因素可能会影响基因表达，而且每个样本的成本仍然相当高。总之，scRNA-seq为糖尿病的治疗提供了新的方向，虽然距离scRNA-seq的广泛使用仍有很长的路要走，需要提高基因覆盖率和保真性，减少技术误差，但是随着技术的改善和研究的进步,该技术会成为糖尿病及其他代谢性疾病诊断和治疗中的重要工具。