细胞损伤与保护实验二.ppt

细胞损伤与保护实验（二）,设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复用不同的实验方法检测、验证实验结果,实验内容,细胞电子显微镜检测细胞活率测定亚细胞结构的分离与鉴定,实验设计,昨天细胞传代:1.（电镜）中午每班传细胞入含小盖片培养瓶3瓶 晚上1瓶正常、2瓶损伤 次日损伤2瓶中，其中1瓶损伤恢复2.（活率）中午每组传细胞入96孔培养板9孔 晚上3孔正常、6孔损伤 次日损伤6孔中，其中3孔损伤恢复3.（分离）每组传代细胞（1传2）25ml培养瓶2瓶,细胞电子显微镜检测,细胞电镜标本制备,原 理,光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构，我们把这些细微结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。,电子显微镜与光学显微镜 的结构，从原理上来说是相似 的，但也有不同之处。,首先不同的是用电子束（电子流）代替照明光源。其次，电镜使用的是电子透镜，而不是光学透镜，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜，它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后，造成电子散射角度不同，使荧光屏上的电子强度也相应不同。,电镜制样技术,由于电子束的穿透能力有限，为了获得较高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为4050nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性，为此，样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。,超薄切片的制备,1、固定：四氧化锇（OsO4）和戊二 醛等，四氧化锇进行后固定。2、包埋：环氧树脂和丙烯酸树脂等。3、切片：玻璃刀用超薄切片机切片，厚度4050nm，切片收集在 铜网或镍网上，在电镜下观察。4、染色：常用的染色液是醋酸双氧铀（易 染核 酸）和铅盐（易染蛋白质）。,结 果,在电子显微镜下观察 比对正常、损伤及损伤后恢复标本照相分析总结,要 求,送标本照片结果分析,细胞活率测定,MTT比色法,原理,四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶，能使外源性淡黄色的(MTT)还原成难溶于水的结晶，并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。,器材与试剂,器材：培养细胞(96孔细胞培养板)酶标仪、移液抢、抢头等试剂：5mg/ml MTT溶液二甲亚砜（DMSO）溶液 DMEM培养液（高糖、无糖）,实验步骤,1、接种1.5104/ml细胞于96孔板：每组9孔2、每孔加200ul培养液：3孔正常（高糖）、3孔损伤（无糖）、3孔损伤恢复（无糖 有糖），37oC、5%CO2、饱和湿度下培养；4、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养 液180ul、再加 MTT溶液20ul，继续培养；5、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO 溶液150ul，振荡1分钟；6、酶标仪492nm波长处比色。,12h,结果,活细胞被染成紫色，而死细胞不被染色记录酶标仪上光吸收值，记录结果分析每组细胞生长情况,注意事项,每孔的细胞密度不能超出1x105/ml，避免影响实验的区分度；高浓度血清会导致实验本底增高，比色前尽量使血清浓度不超过10%。,亚细胞结构的分离与鉴定,细胞核的提取,原 理,细胞内各种细胞器质量不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。,器材与试剂,培养细胞离心机、天平、离心管、显微镜、滴管等、染色缸消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、甲醇固定液、Giemsa染液,操 作,收集细胞（消化法）离心(1000/min5)沉淀加0.075M KCl 4ml，冲打，静置20min离心(1500/min10)取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀离心（2500/min10）取沉淀加少量固定液涂片酒精灯烤干甲醇固定5 Giemsa染色5 自来水冲洗吸水纸吸干玻片（反面）显微镜10倍或40倍下观察（鉴定）,结 果,细胞核染成深兰色,注意事项,注意正确使用离心机（平衡、对称）正确使用显微镜PBS使用液临用前稀释（PBS：Gimsa原液9：1）,back,告 知,实验（三）凋亡相关基因在不同细胞中表达差异检测（免疫组化法）时间：10月25日,