工业微生物代谢控制育种.ppt

第八章 工业微生物代谢控制育种,主要内容：概论初级代谢的调节控制次级代谢的调节控制代谢控制育种,代谢控制发酵大体过程如下：,以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积。,代谢控制发酵的关键：取决于微生物代谢调控机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。,实现代谢控制目标的手段：代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养，而代谢控制育种则为主要支柱技术。,微生物菌体积累的发酵产物主要有 酶 代谢产物（酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质、抗生素、维生素、脂肪、多糖等）,这些产物中有些是某种微生物在一定的环境条件下生成的，如酒精、乳酸等；也有许多产物是生理正常的微生物不能过量积累的，必须是具有特异生理特征的微生物才能积累。人为地改变微生物的代谢调控机制，使有用的中间代谢产物过量积累，这种发酵称为代谢控制发酵。,考察工业微生物发展史，可以看到经典的诱变育种具有一定盲目性，而代谢控制育种将微生物遗传学的理论与育种实践密切结合，先研究目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制，然后进行定向控制育种。代谢控制发酵的出现与发展，与以下几方面是密不可分的：生物化学的发展，确立了代谢图谱，同时发现了代谢过程中的各种调节机制；分子生物学和分子遗传学的发展，可以人为地在DNA分子水平上改变微生物的代谢，多方面利用微生物的代谢活性；合理控制环境，采用过程控制方法，对发酵过程进行最优化控制，使目的产物大量积累。,第一节 概 论,二、次级代谢产物和次级代谢,根据Demain的定义：“次级代谢产物是对产生它们的生物体本身不需要的一种产物”。这些物质有抗生素、生长刺激素、生物碱、色素、毒素以及甾体等。通常把以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系称为次级代谢。,三、初级代谢与次级代谢的关系,1.菌体代谢方面 抗生素是微生物的次级代谢产物中的一大类。微生物的初级代谢与次级代谢既有区别，又有联系。,许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支(叉)中间体。,次级代谢产物的合成，至少有一部分取决于与初级代谢产物无关的遗传物质，并和由这类遗传物质形成的酶所催化的代谢途径有关，它们多数是特异菌株。从代谢途径来看，次级代谢产物是以初级代谢产物为前体衍生出来的，见下图。,由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的生物合成途径有七种。在这些次级代谢途径中所涉及的酶有的是初级代谢酶，有的是次级代谢所特有的酶。初级代谢与次级代谢都受菌体的代谢调节，在调节控制上是相互影响的，当与抗生素合成有关的初级代谢途径受到控制时，抗生素的生物合成必然受阻。葡萄糖碳架参入途径 莽草酸途径 与核苷有关的途径 聚酮糖和聚丙酸途径 由氨基酸衍生的途径 甲羟戊酸途径 其他复合途径,综上所述，在代谢途径、酶系关系以及调控上，次级代谢与初级代谢都有着密切关系。因此，在研究次级代谢时，必须与初级代谢联系起来考虑。,2.遗传代谢方面,初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNA的调节控制,而次级代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制,即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质(质粒)的控制.有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制，因而产生了质粒遗传的观点。也有只由染色体DNA控制的抗生素产物。,次级代谢产物生物合成与初级代谢产物的关系,第二节 初级代谢的调节控制,一、酶合成的调节,通过调节酶合成量进而调节代谢速率，是在基因水平上（原核生物中转录水平）的代谢调节特点：间接缓慢、节约能量和原料酶合成调节诱导酶合成阻遏酶合成 酶合成调节的类型诱导：当环境中存在诱导物（底物及类似物、底物前体）时，促进酶合成，诱导方式有同时诱导、顺序诱导 阻遏：过量代谢产物阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而控制代谢，减少末端产物的合成,酶合成调节的机制,乳糖操纵子的调节,色氨酸操纵子的反馈阻遏,DNA,葡萄糖分解代谢物X阻止CAP-cAMP 的形成，从而阻止了RNA聚合酶与启动基因上结合位点(RNApol.)的结合，即使有诱导物乳糖存在，与乳糖代谢有关的酶仍无法合成,二、酶活性的调节,通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。（一）调节方式：包括两个方面：1、酶活性的激活：在代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进2、酶活性的抑制：包括：竞争性抑制和反馈抑制。概念：反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。凡使反应速度加快的称正反馈；凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）；反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除,1.直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶苏氨酸-酮丁酸异亮氨酸反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节，顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。,（二）反馈抑制的类型,（1）同功酶调节isoenzyme,定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑制相应酶活性，对其他产物没影响。举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节,（2）协同反馈抑制concerted feedback inhibition,定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。,（3）合作反馈抑制cooperative feedback inhibition,定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。,（4）积累反馈抑制cumulative feedback inhibition,定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。,（5）顺序反馈抑制sequential feedback inhibition,一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节,（三）反馈抑制的机制,尽管反馈抑制的类型很多，但其主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节。变构酶的酶蛋白分子一般都是由两个以上亚基组成的多聚体，具有四级结构，这是能够产生变构作用的物质基础。变构酶分子具有两个结合位点，一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。,变构效应：当效应物与调节中心结合后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的亲和力和催化能力的改变，激活或阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了酶活力，使整个代谢途径的快慢受到调节。,27,突变前 突变后 反馈抑制与抗反馈抑制突变,效应物,底物,三、反馈阻遏与反馈抑制的比较,第三节 次级代谢的调节控制,1.细胞生长期到抗生素产生期的过渡在细胞生长期，负责次级代谢产物合成的酶处于抑制或阻遏状态，进入稳定期，这些酶便开始被激活或被合成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。(1)一种诱导因子在生长期末积累或从外源加入以解除生产期的阻遏作用。(2)初级代谢的终产物对次级代谢途径的反馈阻遏作用，当终产物耗尽后，受阻遏的基因就被解除阻遏。(3)在一种易被利用的糖源中生长，其分解代谢物对抗生素合成有阻遏作用，当这些阻遏剂被利用后，便解除了阻遏作用。,2.酶的诱导作用 在细胞营养期一般不出现催化次级代谢的酶，在稳定期发生了次级代谢酶的诱导或解阻遏而生成。如色氨酸（或其类似物）刺激麦角菌诱导合成麦角灵生物碱；蛋氨酸刺激顶头孢霉生物合成头孢菌素C。,(4)抗生素合成途径受高能化合物的阻遏，当ATP形成减少后，阻遏作用随即解除。(5)在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，它不能附着在生产期操纵的促进子的位置上，结果次级代谢途径的酶合成受阻遏；当生长停止后，酶的结构改变，允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用，负责抗生素合成的酶开始生成。,3.分解代谢产物的调节控制 葡萄糖效应（分解产物阻遏）：在含有葡萄糖和第二种碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，只有在葡萄糖耗尽时，利用第二种碳源（如半乳糖）所需的酶开始合成，并解除对抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈现明显的阻遏作用。,4.磷酸盐的调节高浓度磷酸盐对许多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高浓度磷酸盐只长菌体而不合成抗生素；但磷酸盐太少时，菌体生长不够，也不利于合成抗生素。因此，发酵工艺上要严格控制“亚适量”的磷酸盐浓度。5.NH4的抑制作用在抗生素发酵中，供给高浓度的容易被利用的无机氨态氮或其他迅速被利用的氮源，由于它们促进生长，而强烈抑制抗生素的合成。,6.初级代谢调节对次级代谢的作用许多次级代谢产物来自初级代谢的关键中间体，因此次级代谢也就受初级代谢调节的影响。7.次级代谢的反馈抑制（或阻遏）许多抗生素能阻止自身的合成。8.次级代谢的能荷调节能荷调节机制对次级代谢途径的控制也是有效的。,第四节 代谢调节控制育种,从工业微生物育种史来看，诱变育种曾取得了巨大的成就，使微生物有效产物成百倍、乃致成千倍的增加。但是诱变育种工作量繁重，盲目性大。近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论：（1）可进行外因控制，通过培养条件来解除反馈调节而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向进行，即实现代谢控制发酵；,（2）还可进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变株，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢控制育种。内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢的更为有效的途径。代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了效率。代谢控制育种很快在初级代谢产物的育种中得到广泛的应用，成就也十分显赫，几乎全部氨基酸和多种核苷酸生产菌株都被打上了抗性或缺陷型遗传标记。,代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。,下表列出微生物代谢控制育种措施,一、组成型突变株的选育,组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。,39,筛选方法及实例：创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落，从而把组成型突变株选择出来。,40,限量诱导物恒化培养法 控制低于诱导浓度的诱导物作碳源进行恒化连续培养。诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长。通过连续不断加入新鲜基质，野生型就会被“洗出”，组成型突变株就被不断“浓缩”，最后达到能分离的浓度。,41,循环培养法 不含诱导物培养基 含诱导物培养基(普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）,两菌都能生长，但组成型突变株已能合成特定的酶，亲株不能,变异株调整期短，亲株调整期长，短时间培养后，变异株所占比例增大,反复循环培养几次后，变异株所占比例逐渐提高，然后进行分离,鉴别性培养基的利用 将诱变孢子悬液涂布在甘油作唯一碳源的平板上，培养后长出菌落。然后在菌落上喷上O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），组成型成黄色，诱导型呈白色。,原因：组成型突变株在没有诱导底物存在时仍能产生-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑选。,43,筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例如：利用苯-半乳糖（PG）筛选-半乳糖苷酶组成型突变株。,二、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,（一）在初级代谢调节育种中的应用,1.在直线式生物合成途径中,（利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸量，这样就将反馈作用物浓度控制在反馈机制的浓度之下）,2.在分支式生物合成途径中,分支途径肌苷酸发酵（IMP合成途径的代谢调控）,调控理论的实践应用,（二）在次级代谢调节育种中的应用（自学）,三、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用。,渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。获得渗漏型的方法是把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的现象。筛选抗反馈调节突变株，其原理类似于营养缺陷型，只是不必添加限量的缺陷营养屋。,四、抗反馈调节突变株的选育,(一)反馈调节和抗反馈调节突变 1.反馈调节 是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。,50,反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径上酶合成的抑制作用。反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，从而控制整个代谢途径，具有快速、有效、经济和直接的特点。反馈阻遏作用是胞内产物过量后终止酶合成的一种机制，与反馈抑制相比，反应较慢，并且往往影响代谢途径中所有酶（整个操纵子）的合成。,51,2.抗反馈调节突变 是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反馈抑制突变和抗反馈阻遏突变。抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突变株。（调节中心发生结构改变，无法与效应物结合）抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突变株。（调节基因突变或操纵基因突变）,52,3.抗反馈调节突变株的筛选 筛选抗结构类似物突变株 利用回复突变筛选 初级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物零产量回复突变筛选抗反馈调节突变株（高产株零变株高产株）,53,(二)抗代谢类似物突变型的筛选,1.代谢类似物与抗代谢类似物突变 代谢类似物：结构与（初级）代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用而不具备其生理功能的一类化合物。,54,Threonine AHV-Amino-hydroxyvaleric acid-氨基-羟基戊酸,55,Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-Cysteine,S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸,56,真正代谢物功能：合成大分子（终产物一般为初级代谢产物，为生长必需）；调节功能（反馈）代谢类似物：只有调节功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代谢类似物，将关闭相关代谢物的合成，从而影响微生物的生长。,57,抗代谢类似物突变株：在含有代谢类似物的基本培养基中能够生长的菌株被称作抗代谢类似物突变株。通过基因突变，使变构酶或阻遏蛋白的结构发生改变，使其不能与代谢终产物结合，从而解除了代谢终产物的反馈调节作用，所以即使在代谢类似物存在时，也能合成相关代谢物，从而能够生长。,58,2.抗结构类似物突变株在代谢调控育种中的应用 抗结构类似物突变的实质是解除了反馈抑制或反馈阻遏，因此，在这类突变株中，合成代谢途径也不再受代谢终产物的反馈调节，能够在终产物过量积累的情况下还不断合成该产物，从而可以大大提高这些终产物的合成量。抗结构类似物突变在氨基酸、核苷酸和维生素等初级代谢产物的高产菌株选育中被广泛应用。,59,3.筛选方法 一次性筛选法：将经过诱变后培养的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株（药物不很贵）；梯度平板法：将经过后培养的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株。,60,注：如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物 抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高 抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等共同使用，提高产量的效果会更好。,抗性突变株的高丝氨酸脱氢酶已不再受苏氨酸的反馈抑制，从而可使发酵液中苏氨酸的浓度达到13g/L；通过对此突变株的进一步诱变而获得的甲硫氨酸缺陷型株，其苏氨酸浓度可达18g/L。,62,结构类似物和代谢终产物,B.Flavum抗性菌株高产苏氨酸的代谢调节,作业：1.何谓抗反馈调节突变型？如何进行筛选？2.简述抗结构类似物突变株过量积累代谢产物的原因。3.何谓组成型突变？如何进行筛选？,