蜡样芽孢杆菌的检测.ppt

,（第一次课）,蜡样芽胞杆菌概述,一 形态与染色,本菌是革兰氏阳性杆菌，1.01.2m35m,菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜，多成短链状排列。本菌生长6小时以后可以既可以形成芽孢，形成的芽孢小于菌体横径，位于中心或稍偏于一端。,营养要求不高，在普通培养基上可生长良好，最适宜温度为2835。菌落较大，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或蜡状，边缘常成扩展状。在普通肉汤上培养基呈浑浊生长，常形成菌膜或壁环，震摇易乳化。,二 培养特性,三 流行病学,蜡样芽胞杆菌,病原菌,条件致病菌,肠毒素,耐热,不耐热,食物中毒,人或动物非肠道传染病,eg:结膜炎,呕吐型污染食品：米饭我国多见,腹泻型污染食品：蛋白型食品及果汁 欧美等国多见,污染途径：泥土和灰尘昆虫不洁用具不卫生的食品从业人员,实验目的,不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落。产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂，在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。产生酪蛋白酶：分解培养基中的酪蛋白，生成L-酪氨酸在菌落周围形成透明圈。,实验原理：蜡样芽胞杆菌具有以下生化特性：,产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）中的血细胞发生溶血。产生明胶酶：将明胶水解为多肽再水解为氨 基酸而使其由半固体转化为液态状。触酶实验:产生过氧化氢酶分解过氧化氢生成水和氧气。动力和硝酸盐试验:蜡样芽胞杆菌运动活泼,能还原硝酸盐为亚硝酸盐。,实验材料,甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板营养琼脂培养基L-酪氨酸营养琼脂培养基胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)动力-硝酸盐生化鉴定管木糖-明胶生化鉴定管硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液,0.2%-萘胺溶 液)3%的双氧水革兰染液,检样50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液,10-110-6稀释液,30C,24h,形态观察 菌数测定,选择性培养基 MYP,营养琼脂,30C,24h,革兰染色,生长及菌落观察,鉴别试验,生化反应,肠毒素测定,报告,检验程序,实验步骤,1 样品的保存和送检 待检样品应保持在6以下运送并尽可能不使其冷冻。对可疑是该菌引起的食物中毒的病人，应取可疑食物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在3小时内送检。送达实验室后，应保存于4并尽快检验。,实验步骤,2：样品稀释及计数：,各稀释度0.1mL，L型玻棒均匀涂布,MYP 琼脂平板,计菌落数,30，24h,10-1,10-6,3 分离培养,计数后，从每个平板选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面做纯培养，30培养24h，进行形态观察和证实试验。,第二次课,分类,需氧芽孢杆菌根据芽孢囊膨大与否及芽孢的形状，可将其分为3个群。第一群的芽孢不突出菌体，形成的芽孢为椭圆形或圆柱形；第二类的芽孢囊突出菌体，形成的芽孢为椭圆形；第三群的芽孢囊突出菌体形成的芽孢为球形。蜡样芽胞杆菌属于第一群。该群内细菌，根据营养型细胞的宽度可以又分为两类，其中宽度0.9m者称大细胞群，该群有蜡样芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、紫云金芽孢杆菌、炭疽芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌。这几种与蜡样芽胞杆菌形态上相似的4个菌种必须用微生物学和生化学试验进行鉴别。,4 证实试验,L-酪氨酸琼脂培养基,预实验营养琼脂培养基,菌落形态观察,镜检观察菌体,生化实验,卵磷脂酶实验,L-酪氨酸分解实验,动力与硝酸盐还原实验,革兰染色,MYP琼脂平板,动力-硝酸盐生化鉴定管,鉴别试验,1 形态观察,本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体中央或偏端，不是菌体胀大。,1 MYP平板上：粉红色菌落，菌落周围产生粉红色浑浊圈。2 L-酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈。3 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡。4 TSSB平板上：菌落周围产生的溶血圈。（在菌落周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象，而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。5 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长，加硝酸盐试剂后培养基变红。蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，蜡样和紫云金芽孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽芽胞杆菌则不运动。,2 实验结果,实验结果,3 计数（表面涂布法）,1克样品中含的蜡样芽孢杆菌数：,举例：将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g样品中含的蜡样芽孢杆菌数为（254/5）1041/0.1,