原位杂交操作流程.ppt
原位杂交操作流程,冰冻切片的（DIG-labeled RNA probe）原位杂交操作程序一、切片制备用新鲜组织制作6m厚冰冻切片，37干燥14小时，进行下一步操作。二、预杂交前处理预固定：4%PFA（in DEPC-PBS Ph7.4）RT 3060min 4%PFA：多聚甲醛 20g 1PBS 450ml 加热（60、20min）溶解 冷却后调pH至7.4 1PBS 500mlPBS RT 5 min2 10PBS：500ml NaCl 40g KCl 1g KH2PO4 1g Na2HPO4 7.7g DEPC水 450ml 调Ph至7.5 DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT 15 min 临用前配制 10%TritonX-100 15ml 1PBS 500ml PBS RT 5min 2,消化：2g/mlProteinase K in TE buffer 37 10 min TE：pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml pH8.0 EDTA 0.5M 1ml DEPC水 500ml 0.2%Glycin in PBS RT 5 min2(50 xDenharts;Ficoll 400 聚蔗糖 1g 后固定：4%PFA in PBS RT 15 min PVP 聚乙烯基吡咯烷酮 1g BSA 牛血清白蛋白 1g DEPC 水 100ml）PBS RT 3 min20.1M 三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐 RT 5 min2 0.1M 三乙醇胺：三乙醇胺 2.64ml DEPC水 200ml 用前加入乙酸酐 500lPBS RT 5 min2,三、预杂交 预杂交 50 2h 预杂交液：50%去离子甲酰胺 5SSC 5Denhardts 0.02%SDS 0.1mg/mltRNA四、杂交杂交 50 12h以上,五、杂交后处理2SSC脱去盖膜（片）502SSC清洗 37 10 min2 20g/mlRNaseA in Rnsae buffer 37 30 min Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W 1000ml Rnase buffer 37 30 min 2SSC 50 15 min2 1SSC（含0.02%SDS）37 15 min2 5%SDS 2ml 1SSC 500ml 0.1SSC 37 15 min2,Buffer 37 10 min2 Buffer:2M Tris-HCl Ph7.6 25ml 3M NaCl 25ml D.W.500ml封闭；0.5%抗体阻断液 in Buffer（含0.2%Tween20）37 20 min 抗体阻断液:(1:500抗地高辛抗体 in 阻断液 37 2 h)阻断剂 1g Tween-20 0.4ml Buffer 37 10 min2 Buffer 200ml Buffer 37 10 min2,显色；Buffer:2M Tris 10ml（1:50NBT/BCIP Stock Solution in Buffer 224h）3M NaCl 6.67ml MgCl2 2.033g（湿合、避光）D.W.180ml 浓HCl调pH至9.5 D.W.200ml终止反应：Buffer RT 5min2 流水冲洗 5-10min1%甲基绿复染3-10min，水洗，晾干，封固,DNA探针检测石蜡切片中DNA,组织标本,肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58烤18h。,试剂,120SSC2HBV cDNA-Dig探针 5g34多聚甲醛40.1mol/L PBS，pH7.450.2mmol/L HCl 和0.1mol/L甘氨酸 PBS pH7.460.4 Tritor X-100 PBS pH7.47蛋白酶 20g/ml80.25乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制9预杂交缓冲液和杂交缓冲液10.AKP标记抗Dig Fab段二抗，可1:500稀释11.TSM、TSM2（配制参阅附录4）12.NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit,操作流程,杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断,杂交前处理,1.石蜡切片常规脱蜡至水2.0.02M pH7.4 PBS洗33min3.0.2M HCI 20min 室温（除去蛋白）4.2SSC（内含5M EDTA）50 洗 30min5.蛋白酶 2g/ml 37 20min6.0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室温，中止酶反应7.4多聚甲醛，20min 室温8.PBS洗 33min9.75，85，95和无水乙醇各2min,预杂交和杂交,加预杂交液 20l/每片，42 2h。加杂交液1020ul/每片（内含HBV-cDNA Dig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95 10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2SSC湿合内，42杂交过夜(1216h)。,杂交后漂洗,1.将切片置于2SSC液内振动移去盖片2.2SSC洗 210min，553.0.5SSC 25min，504.PBS洗33min5.10醋酸 20min 室温，阻断内源性碱性磷酸酶6.PBS洗33min,信号放大和显示,1.1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37 4h，或4过夜2.PBS洗 33min3.TSM1洗 25min4.TSM2洗 25min5.显色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l，BCIP 混合后，显色30min12h，中间不断观察6.TSM2洗，PBS洗33min，核固红或甲基绿衬染7.蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片,结果判断,ISH流程,探针合成组织细胞标本的准备ISH试剂的配制操作流程,探 针,1、根据文献报道合成PCR引物一对。2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶 进行PCR扩增。,3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACC I酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lac Z-肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。,4、利用Roche生产的体外转录标记RNA kit（Cat.No 999644）操作流程参阅原位检测技术p132-133。,组织细胞标本的准备 ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）,操作流程,1 1、活细胞经4多聚甲醛固定20min，室温，PBS洗，系列乙醇脱水。2、组织标本：标准取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速冻，切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上。3、PBS洗33min，冰冻切用4%柠檬酸盐90保温20min，石蜡切片98 10min，细胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。,7、预杂交 0.2SSC50甲酰胺 30min 37。8、杂交：滴加杂交液（2g/ml）加一层复盖膜，48杂交8-12h。9、杂交后洗：2SSC洗 25min 45 1SSC洗 25min 室温 0.5SSC洗 25min 室温 0.1SSC洗 25min 室温 PBS洗 33min,10、用10正常血清封闭 30min11、抗Dig IgG 1:500 37 1h12、PBS洗 33min13、0.02M TBS pH9.015min14、NBT/BCIP显色 1h-24h15、洗后，核固红衬染，蒸馏水洗，脱 水，透明，封片。16、结果观察：紫蓝色为阳性信号，红 色为背景。,
