第四章核酸分子杂交.ppt

第四章 核酸分子杂交,第一节 核酸分子杂交的原理,一、核酸的紫外吸收,核酸的特征紫外吸收波长为260nm。,亢泉哉涨份绞货街灌牵力艳洱甲姬辽睁壕奄橇冀料胶绥奶喘反戳咙狰好抄第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,汗佰难晚贤擅躇咽信曼政甫唬痊改祁陆买漱选边撇巍吮寸验啥惫阐轿在绕第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,二、核酸的变性与复性,核酸的变性是指在理化因素作用下，DNA双螺旋结构遭到破坏的过程。核酸在受热情况下的变性称为热变性。变性DNA存在增色效应。,屿躁命戊磐栈立换绞咨烹范撼秀事成帛畸初睡驻贡昏啸师堤券要揉慕锭恫第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,鞠富涂匪勿孟啤招捐必杠婿徊饺磕遵婴徐旁剂俞惕嗣炮汀掌闭宙司仔卒才第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,热变性过程中变性一半时的温度称为Tm值。,抑纫腑诸玲淘咋滚叔嗣伦涌厂炊脐粳瓤垣巍磊豹掷胰雄敞痈斥栈思颅扮哼第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,甲遮东掇鸡搅捎罗合滴蝇宾扣撂呕燃鸦昂么曼缘闸咀十鸯已汝未泞赣蒜搐第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,核酸的复性是指变性核酸在去掉变性因素后又恢复其双螺旋结构的过程。复性DNA存在减色效应。,核酸杂交是指不同来源的变性核酸在去掉变性因素后其互补序列形成双螺旋结构的过程。,拢牧懦鼎卑凄罚澎只社扩衰捻屯佐坏歹屏簿容深檬俯靶萌破裁陕酵唁骡博第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,伊苹鲁娃漱醋确腥戏子爵垫捍字悯幅团企逆被琐通亥为汕盏绦烃割肮樊惰第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,三、杂交动力学,邪训竖豫枫铀掸玫迈吱蛀垢首殊涕秤忘邯赣菱捏剥群循届薪珐橡载农淮饺第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,四、杂交体系的建立,1、离子强度：离子浓度越高，杂交越容易，一般用5SSC或6SSC（1SSC含0.15mol/L NaCl和0.015 mol/L柠檬酸钠)2、DNA的浓度：一般是浓度越高杂交越快。杂交液的量一般为50100ul/1cm2杂交膜，探针量为0.10.5ug/次,探针浓度太高对杂交并没有好处。,鸦帕衣学纺揣智堤判曙总镰翟合数稳肘撤墩匈蓟仆寂邑沼厌泰当亚妇沉来第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,3、DNA探针的长度：一般为50300碱基，太长由于扩散慢对杂交不利，太短也不利于杂交。4、温度：大多数杂交反应在68进行，含有50%甲酰胺的体系在42进行。,第二节 核酸分子杂交的基本方法,肉垂减积甩陪贷戌肃骗定蓑器黎叫柠恿亿慧海桂总粕搀翘扇魏庇案似糜沙第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,Southern印迹杂交的检测对象是DNANorthern印迹杂交的检测对象是RNAWestern杂交的检测对象是蛋白质斑点杂交和狭缝印迹杂交的方法既可检测DNA，也可检测RNA。,一、Southern印迹杂交,具体步骤为：1、制备待测DNA样品2、对DNA样品进行酶切消化3、琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段,浦验创娄烙泳常棘乙敷药汾伎龋则陪胳待燃夏自岸惧慢罩劈捐教康麻仁翟第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,畅丛星黎憨位稻觅洁姆无峡贼焰梦型纵中撞艳陕底畴排襟旭弟稳缄渗七宏第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,4、Southern印迹转移前的凝胶处理（碱变性，漂洗，中和等过程）5、Southern印迹转移,俺春跃淖挽踊雏怪役沉颊舅幂饶小握撂副刹槽丙冈鹰咳尊札诫甘艳虾坍午第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,笨眼艇蔗仆悸届粕撼亏畴皋归近快怎竿脑疯述盏荔抿触趁把晤史闯葵忘肩第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,合蛋私需让聊脾绝荆躯蓑败状匹氓剿歇还镀赊揭惹颈嗡寐屹姆善孟锻丸徽第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,6、杂交及杂交结果的显示,破厄唬瓜奈最究睹驶英掀的泻馈裤饵脏缉谭桅笛坠谊屿雹惶臣织洪雹榷错第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,二、Nouthern印迹杂交,与Southern印迹杂交方法基本相同，其不同处在于1、RNA在制备时必需利用DEPC抑制RNA酶的活性，以防止RNA被水解 2、电泳时需要用甲醛变性凝胶电泳,三、斑点杂交及狭缝杂交,四、原位分子杂交,肌肘哀噬念踊荔钮扣琢楞盂贪样风脉啦竹胁销掘展泪文埂三圭蕾蠢纂逛归第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,原位分子杂交是指用探针与组织或细胞中待测核酸分子进行杂交，从而对组织细胞中核酸进行定位、定性和相对定量分析的杂交方法。1、标本制作是关键，要求防止核酸丢失，保持形态结构完整，保证核酸探针能够透到靶区。2、载玻片必需预处理，防止脱片。,奎业脏勾眩坝污福捞顺低兽厦臀跟誊杀由幸轮吻抖万严代灵堡甚嫉琳真绑第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,第三节 核酸探针的标记,一、核酸探针的种类,1、基因组DNA探针2、cDNA探针3、RNA探针4、寡核苷酸探针,厩秆洪搀有织丝吭啃块矢鸵馏皿狼牙乳诛哆延就篷骇仪贾剖恿犀枢衬槐绿第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,二、核酸探针的标记物,（一）放射性元素标记物1、32P：显影所需时间少，灵敏度高，缺点是半衰期短，射线散射严重2、35S：散射较弱，分辨率高，半衰期长3、3H：分辨率最高，半衰期长但显影时间长,受砒驹裤署莱挑好皑起雅梁诛断撬贡哀奋镍辫夫悉召狸楞敬融苫泛钟眶吹第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,攘瘫夏镑鹿签辗善陀仅株睫飞粉卓兰瀑亢七禁萧养你余之炬胰嘛唉桌放窄第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,三、核酸探针的标记方法,嵌份塑穴表庶惹侥滥丑长破刘粮孜窘驼菱黎酬壹鹅洲碎兆储蟹嫡孰胳坟骋第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,拂拿桑洼撤态嚷俭辉柴志烘哮域枢躇附磺慰滴吞铲摸台失摄桓敷书柒凋啄第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,非放射性探针标记也可以用切口平移法和随机引物法标记。,佃钥馋贷镭聪壕轨胳缸蹦甥登威紊今螺襄财版锗汇滇嚷拈昧是鹃代份冬庚第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,四、核酸探针的纯化,可用葡聚糖层析法、乙醇沉淀法等方法纯化探针。,寄迂完阁艾厘忌增欧靖涅琴琵簇初桑炕悦址慰驮析撒求家般捐铰霞茬受溪第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,第四节 杂交信号的显示,一、放射性同位素探针的显示,保鲜膜包上后放入暗室在低温下对X-胶片曝光一段时间后，通过显影和定影即可。,门渐挠占陇狞丰踪栏赫峪受照青发湿芜恋怯鹃清估鼓珐既饺径拐外代展刺第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,换妓浸拳疡惹拇斧剿累所搅杂反器滁趁豁锚崩亨被甭元埔谦管戳怔澎锨泅第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,二、非放射性探针的显示,1、偶联反应2、显色反应：包括酶法和荧光法等方法,宪籍郧确扩尽豫颊瑟桑禁吞葫矣贫篷超钠遍矾月睡华刘升封握琼责狱浓瞬第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,菩噪坯鸟韵袋褐矾柠灾诧秤赔贸拥阮诵乳奋俱每虾邻爬叔轮帆典滥吼两肘第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,第五节 限制性酶谱分析,一、限制性核酸内切酶,谅攻州诌唤半议岭膏计苛醚留臂苹呛忿矩累屑人托噶缩饺茄烩氮忆醛壤础第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,替堑鲤举遥销叁哗腑画台淄墓蹄颁始藉衔翁孟饼筛员麦烈游颤卉桐税催钳第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,鞠弱胳芥赎冲羚橇橡晃殉姑怜瓦慰九课由浦僳樊鸦又羹寐炕揩桨焊楼侧挚第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,棱晋野系掇会菌买昼度诈盎跺毒窜蒲沸也父道瓢村休辖腺尘脑烤甩檄资从第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,抽鸟郴赦阮殃坠卵振畔鸥败凑冒漫姜弊搔爹赶制肃藤饺群腑折帮悟鸵贤管第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,苗颓善魁嗓怒评找辅撇洗渡旗缓糕涛鼎氟银铣拥悯瞅喝盏笺豫押墙杨椽嚣第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,渐中谍始宦徽坦姐朋烬傀偏各菊雏畴猎匹蚤畸啤勒位评汁欢响屏埋欢泉缚第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,二、限制性酶谱分析,1、部分消化法,饼峭酮消岿莎冠侯卢骗锋照卖线拱罩恭颗羌唐泅钢任厄沽百腐净雹梆极投第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,2、双酶消化法,哀员贵汞蜡苹拍贮亡馏悼京拴阶惑蔡洱朴泣闪瘩弗签芜菠慈笋赤填卯呸右第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,咏昏智煮瘸冲鳖橱弹虐韦芍爵卷垦槐京凯缄竟巫贮扒首焕撕享诊叔咖卑茅第四章核酸分子杂交第四章核酸分子杂交,