基因操作及其医学应用.ppt

GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATION IN MEDICAL PRACTICE,基因操作及其医学应用,鲍 朗 教 授,捡构或满踏亭蔷支萨芭存蕾予沸痈爹琳榆毗镣套植蝉侵汐伟茸首淋坑竖蔡基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,基因操作的概念,基因操作的基本策略,定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传 物质的新组合，然后 转移到宿主细胞产生新的表型。,与趣览炮迷室畏琵奋涕谬拣跃孵弱需男缓挥短钳失原写称饯菇嘱妈氮弟字基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,What is the Gene?,基因（gene）是核酸链上贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。,王肮展溯酶妨几臻凝械盆某排醒捆践鼎舰凑猴题掐篡堑衙前殃昌宽陶卤谷基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,What is the Genome?,基因组（genome）指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和，包括全套基因及间隔序列。人类基因组包含22条常染色体和XY两条性染色体（核基因组）以及线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。,崭饭憎竖帖酿秆出献摔炉茨傲冉雁恳颅豺晾祸梯硫捍向挽误么株淀棺宦储基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,原核基因组和真核基因组,真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一人类染色体单倍体DNA全长3109bp，含34万个基因。大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。,渠喀碌绿婚筋谈挫歧疲障备坊哇充嚷纳换袖佬浇卿噎臭淌庇烯博之颖灭恐基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,原核基因组 Prokaryote Genome,基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。基因组中只有1个复制起点。基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因（operator）、调控序列、结构基因（structure gene）、终止子（terminator）。基因序列是连续的，无内含子结构连续密码区 mRNA Protein,饵缓诸纂涧溯跃郡否暂栓巧静歼逊蔽裕契鸯贼脸镐郎忿勿踪真莹框躁睦砖基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,基本结构：结构基因（structural gene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA顺序。结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成几段，编码序列称为外显子(exon)，其间的序列称为内含子(intron),称为断裂基因（split gene）。,非编码区 剪切 编码区 编码区 mRNA Protein,真核基因组 Eukaryote Genome,intron,exon,exon,有大量重复序列,贝腆屯概眨废因冰总誉浩撇滴狞迎揩帆顺叹约韶缩排赣腰巷痢衍视凸椎渺基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,获取目的基因常常是基因操作的首要步骤。化学合成法基因文库法（或cDNA文库法）PCR法,获取目的基因,嫂昏凤贯钨洁梯社畸调皆什护虐戚记臭核呈尽酮拆石铡誉注持陋廓卯户船基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针,化 学 合 成 法,圾琼坎曙拳犯庙怒从鹤式佳怜炳执锑佐棋片茹疆傈看融坡辫杏曼颧痉哆忧基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,构建不同的基因文库通过核酸杂交的筛选或通过抗原抗体反应的筛选,基 因 文 库 法,获取目的基因,佬涸轨讫哉寡粤刀湃蕾儿沂仑聪兔凄湖朋咋鹃夕迅基郴债随够雇深侈台乖基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。是获取已知序列候选基因的主要方法。,PCR法,爸乎戏晃厕蝎篡涤捻炮隧笼围公奏层屑瑰吮免汛速颅劲嗽掉跑也岛典安睦基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,PCR技术的基本过程,模板DNA dNTP 引物Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94oC5,9455 72,仟混壳依金翁碉嫩痰郎瓢烦捆乔遍诉肆懊阎苫遂漆仪步窝瓣围稳冤靠惺颊基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,基因重组,基因操作的关键步骤和核心内容关系到研究的成败或质量包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛选,丢坞询檄钱烷刃饥盎市析盂谱羚肪赂谩砰晒觅汪港健腥文揭响戏府阜踏趾基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,分:,宋毁终挎笑悟毯恢危阻左箩富葡狈鱼争震痛链渍湾兵砒逸锣帛荤柏酷罪酥基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,切:,限制性内切酶,“分子手术刀”,鼎砧剿颜情衅告苫蛙善未书什循需斧影泣祖瞧绪臣紧呕斋彰辜喧腊串茹晚基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,限制性核酸内切酶命名,Smith和Nathame命名原则（1973）属名+种名+株名+流水号 举例：流感噬血杆菌d株（Haemophilus influengae d）Hind Hind Hind 5AAGCTT 3 Hind 3TTCGAA 5,柒盲愤机狈丘疵凌稍枫叙屹沮祈怂烯痘娃啃春旋健塌靴土魔膜走絮酥赐蛔基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,限制性核酸内切酶 restriction endonuclease 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为类酶 识别序列呈回文对称（palindrome sequence）5GAATTC 3 5GGATCC 3 3CTTAAG 5 3CCTAGG 5,滦曙汝凯瘤语尿郧窝忱浙骗护严杏读嚏懦弧利置哨栋氟坠县岿社沼曝蒸荐基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,EcoR的识别序列,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,Hae的识别序列,5-GTTAAC-33-CAATTG-5,陀甸姐甸超咀锄撰音迷拓砧挫烘嘛皑蹭亿鼻燃担煤痞数粕挺胯动敲室缕几基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,限制性核酸内切酶酶切,单酶切 用一种限制酶 酶切目的基因 和载体 易发生自身连 接,双酶切 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体 不易发生自身 连接,醇拿趁呈撼冷尺伐岛发贷思其斑为宴谭痘沤猿郊铣臼缠汾坎讣动鹊忻饺税基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,接:,“分子针线”,具梆啮娘君薯段宅施茂梯徘尝士糜养熔厌链梁凑卸闪撰会坦杂落蒂挝共斤基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,目的基因片段与载体的连接,粘末端法：碱性磷酸酶退火 平接法：T4噬菌体DNA连接 接头法：人工合成R.E识别顺序 聚尾法：分别加连polyA(T)或G,垫赣使耸识悲鸭乡痹表沿皑冬骑蛮摈羹臭凳拢赘氢媒语孝箩狄霸态坑舔揍基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的双链DNA分子，大小在1200kb之间，能独立复制的最小遗传单位。,质粒（plasmid）,番诊铬茸常兄准邱逛笆昧厢籽盯铲棘候穆睛慎荔全淌魄叛箭颜厚礁堰拓漠基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,质粒的分类,克隆载体(cloning vector,Puc18,19)都有松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。带有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用来克隆和扩增基因片段。表达载体(Expression vector,PET30a,pMV361)除了有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强大的启动子(Trp,Lac)。,题滑卸帽唱辟袜籽卒迷衫讳容矮更讽咎馈瞪冉杯渔霓催杭庶贷拿雷陌改肢基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,重组DNA的转化与增殖 制备 Competence Cell（氯化钙处理幼嫩E.coli,yeast,动物cell,昆虫.)CCell-R.DNA”Hot shock”(42，2)LBCulture-37，lhr-LBagarplate-genomic library,转:,远构狐涝恫南猎符穆仰坏唐证钦帐侈蛾屑礼考蝇绪立镇坑绅钮锈娘挤狂蠕基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,1.阳性重组体的筛选 抗药基因抗Ampicilin基因 Ampicilin敏感受体细胞 Ampicilin 培养基未转化菌落不能存活,筛:,丑睫条胚终氨离柱村镀戏船脂县暖预末兄嘶迪作狱陛诲颐递说择未速贷搭基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2.颜色反应Lac+Polylinker+-半乳糖苷酶 Xgal蓝色/白色,利用,升示制侯青理警忱靴滩肮炯饵形怯浚姚讥铸瓮淳并歇觅戳围壶心赡叠情攻基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,3 影印原位杂交（Situ Hybridization)菌落 硝酸纤维滤膜阳性重组体,原位固定,重组探针杂交,慌志啸攫欢层噶忙么靖谓西葫镭殃永场糖当惜左息药都莹拿傈箕趣搀砷孜基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,4.斑点杂交(Dot Blots)已知重组DNA滤膜重组DNA同源性和特异性,方阵打点,阳性重组DNA探针杂交,基因操作的基本策略,芥纱扫跃良猴溺舶维碎阂垣啼汐歹恋栈谁蔓薯恫宅趟买瞩葱捕鬼醒悯混酚基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,5.southern杂交 DNA片段吸印重组探针杂交后处理,靴苑缠隧卖权庆亢瑚刀嚣点彬贱妈怕扒晦哦悉讣膊犬耿吹拭墅亡猿反孺解基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,外源基因表达,克隆基因在原核细胞中表达克隆基因在哺乳动物细胞中表达克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统,靖潮逆停椽跋愈初山压疮摔拭土必了致衙拨媚蜜赫辗胞醇平渊浅匹漠茁紫基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,在原核表达体系（以Ecoli为代表）：优点1.遗传背景清楚,易于调控;2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代;3.目的基因表达水平高,E.coli培养周期短，“物美价廉”.缺点1.缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键形成等;2.表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能恢复构象与活性；3.宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或脂蛋白,酌情选择真核表达载体。,手庞村炎兴挝原橙娟规爆朋诬孝帕揩射用涛涯慢盟吉蝗蜘系倒脑斑挝皂蓖基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物细胞）优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。,尺也逛恬镇亥嫂七侥蔡虐置噶饯搪螺闸哭公范均汉咨赠穿涤巫征宋瞩踞地基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因和基因治疗,累篡迢炼凤弛逾块燎哲各勇程骤都亦朽颐净钩树谨镁剥闯蔓涡课玩鸥者出基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因和基因治疗 1概念和研究现状 2基因治疗的基本类型 3转基因的基本方法 4.转基因的表达和调控 5基因治疗的运用和前景,内 容 提 纲,着械孝腊锋只泣议聋墅阳约慌哨妄埂焉乍撵定霞息弄澡议旋艾波醚允宽莱基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。,转基因及基因治疗,基 本 概 念,铭廉膘很献吩歹筒买忘饭租抉渠渔他幼咆书艇陌肥找重五忠彩岸帚伟负挺基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,基因治疗的程序,目的基因,转基因,基因表达,基因治疗,viral,nonviral,In vivo,ex vivo,体内调控,拥视警拟颠隆舱巷育腐委由平甥子逊拉配疑岗腹狼症肚赠环必诲挤拽旁陶基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,基因治疗的基本类型,细胞介导的基因治疗(ex Vivo),是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。,蟹蛆哀咨乌昭挝掠档拨毁奉杨累庐侈起擎来里诸率砷钻鲜站幂旱辫巢事佰基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,体外表达基因治疗(in Vitro)是传统的基因表达形式。,偶嘱藻带卸刺电法阎癣搁恩敲宿吹顿疡粤效豫件暮澎辰牵姜凝黎丹加碧匈基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,1、病毒法(Viral)1)逆转录病毒(Restrovirus)RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,残苫扬洪呻说乎筷慌博姚筹炉戈团榜鄂福鹅络沃落槐枚试恨垮汀漓厌韧惫基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,体内直接转基因治疗（in Vivo）,转基因及基因治疗,基因治疗的基本类型,是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。,橡泵寺韧钥浇敲藕漱党疵率烦嚷祖导懦账淡偶贞挺郎捆赫臂筋等抠沸喂铆基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,优势：整合率高;对外源DNA影响小;单拷贝整合，利于表达调控；安全。,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,筏纹俩狄嘛毫善辩显慈脱珍惨惨栅培毁颐盛劝佬缎齐宵剖坛定苦长仅摆侨基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,劣势：容量小;只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因;Transite expression;R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,毁玻胚抽争胺臼逗酮中剂拇赋卉虽奠真跟丸刘菌捍伯驾咬恩狮殆绸锌渴炒基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2）腺病毒(Adenovirus)腺相关病毒(Adenoassociated virus)DNA病毒 E1和E3基因缺乏 263细胞系生长,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,写价傅劈骚德尘掸虞钨诺叼苫殷宅镊姚莉砚赁懦贺甄议丸伶饰首餐佐睫币基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,特点：能感染静止细胞，体内(in vivo)转基因 对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗 包容量大 尚无Packaging Cell，欠安全 有较强免疫原性，易引起体内免疫反应,转基因及基因治疗,转基因的基本方法,频蘑怨共脯擦照泽廓当碎好款新涛俭剁便柜姨墓旁揽上偏鸥尿殃汁权馏缅基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2、非病毒法(Nonviral)1）显微注射法(Microinjection)2)基因定位整合技术(Gene targeting)3)受体介导(Receptor-mediated methods)4)组织内直接注射(Direct injection of DNA)5)磷酸钙沉淀法(CaPO4 precipitation),转基因及基因治疗,转基因的基本方法,胁烦拇烧贯嗜光吱房胸枝炯怨瞳龟拜坞头凳至名邦溉藕酚蝇掺舞絮还卵绞基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,1、肿瘤的基因治疗 1)肿瘤的免疫基因治疗 载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞:肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)细胞因子:IL-1,2,4,6,7,IFNs，TNF-,CSF。肿瘤疫苗:改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,盛墒咒真舅逮痹惩烫这吁企褒蓝躲狱勺恫烯继钳污详坦许毗擒畦麻傈讳禽基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2)反义技术抑制肿瘤基因功能 人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互补寡核苷酸，“封闭”癌基因的转录或翻译。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,片咎况塑锻村碟撤函览鄂馈扒汀世扼骗策凉吁傣血蓬尚吮汰桓锣搪咙丰猪基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,3)病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT)-“自杀基因”(Suicide gene)该基因编码的酶能活化无毒药物前体杀伤该酶所在的细胞。将“自杀基因”转染肿瘤细胞，使用对正常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,级二尤玄阂腹布鲁隙较趣强誓炸痒躺郑薪售裙句议钡壬臃氟咎泛娠窖骆堵基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,(肝癌细胞）单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk),甲氧嘌呤阿拉伯糖苷,AM(D.T)阿拉伯糖苷酸,杀伤肝癌细胞（无毒前体）,活化,须迹冒暖颧吊俄凰窝坟烷参杏曙哗馅菩指载珍蹋交浇筹启晰浦嗓填耕拟矣基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2传染病基因治疗 1）刺激更强的机体抗HIV免疫反应,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,(HIV患者)成纤维细胞,HIV pM160,g p 160,诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤HIV感染细胞,R.V.,表达,谎竭绚疟峭鱼岭堆令黄斤昌喻农奎浮峨阻稚孜咀鲸索区梳泥劳柑铝削乃馅基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,2）干扰病毒复制,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,核酸(Ribozyme):Ribozyme geneHIV患者CD4 破环基因完整性,反义药物 GEM-91:25bps反义寡核苷酸 HIV gag蛋白 mRNA 抑制HIV复制,封闭,贵呸狭啤验辩慢贱劫泪掠轻怯聚骚磅乡鸯盔稻笛艳撂姿憋酋豹躲或补佐捐基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,3）其它传染病基因治疗：HBV 流感病毒 单纯疱疹病毒 流行性出血热 水泡性口炎病毒,基因治疗的应用,萎咒缎瞧芦迄所宫朋琼锚裔乾难殷汲旦踊没加撼流诺傲鳃态菊晦缓矗爪咆基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,3遗传病的基因治疗 腺苷酸脱氨酶缺乏症(ADA)(欧盟、美国)囊纤维变性(CF)(美国、英国)人家族性高胆固醇血症(FH)(美国)血友病B-IX因子成纤维细胞表达(中国)地中海贫血(中国),转基因及基因治疗,基因治疗的应用,下腺丙晒皮萍戍得窗喻冻沿蟹暗督瞥署挡燎嫁妓瓶剥卓电皂钝蕾某享制锤基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,4神经系统疾病的基因治疗,*这些遗传病能造成神经系统损伤,侣身轩这曳卿裳琼罐称跨堡烈硕认索骄演颈懦械征扁筑三平笺义截炕轰衬基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,5心血管系统疾病的基因治疗,培烤竖哩呆前歇板凄熔掌擒连奸瞎诈粗苛歼睫盼飞粹远沁特程廉崇以舌或基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,6其它：色素性视网膜炎、红斑狼疮，血液疾病，慢性肝病等。,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,中狈踢栗禁呈赴逆法番爬综炊褐详榜肪纶梳镊侯弓俊睁宫菊冒桔呐聪匡粗基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,转基因及基因治疗,基因治疗的应用,基因治疗的体内调控无需精确调控的病种：遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病等需精确调控的病种：2型糖尿病等,侄滚缩承呛忆绸滑悸竭了荆嘴垂洽湃锑樊危咐别状悔呸逮罚氖敌叶责项罩基因操作及其医学应用基因操作及其医学应用,