microRNA 引物设计 参考资料.docx

学习microRNA的引物设计以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，固定的序列为：5, -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为5, -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：5, -ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCGU6 引物 F-CTCGCTTCGGCAGCACA，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT使用方法：1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升 2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP2. hsa-miR-124 （hsmq-0032 引物）推荐退火温度：60°Chsa-miR-124扩增曲线示意图hsa-miR-124融解曲线示意图1臼Ml村旦M73. hsa-miR-125b（hsmq-0034 引物）推荐退火温度：60Chsa-miR-125b扩增曲线示意图hsa-miR-125b融解曲线示意图4. hsa-miR-137（hsmq-0035 引物）推荐退火温度：60°Chsa-miR-137扩增曲线示意图hsa-miR-137融解曲线示意图5. hsnRNA U6引物测试推荐退火温度：60°ChsnRNA U6扩增曲线示意图hsnRNA U6融解曲线示意图6.电泳结果12345取5心PCR产物进行电泳,胶浓度（3%），所有检测都为两个阳性，一个NTC其中泳道1为hsa-miR-16、泳道2为hsa-miR-124、泳道3为hsa-miR-125b、泳道4为hsa-miR-137、泳道 5 为 hsnRNA-U6imgU6RT 引物 GTCCTATCCACTGCAGGGTCCGAGCTIGCACTG GATACCACAA ATATlXAAC PCR 引物上游；TGCCGGTOCTCGCTTCGGC A3通用 下解引物ccactccacwtcccacct