【教学课件】选修课 病理学与临床 病理学与临床.ppt

病理学与临床,重庆医科大学 病理学教研室 赵涌,课程开设的目的,前 言病理诊断一直被称为疾病诊断的“金指标”。但病理诊断不是万能的，病理医生的诊断失误有时也可被临床医生纠正，而临床医生的判断及治疗处理必须依赖病理诊断，为在临床诊、疗过程中不犯错误或不犯大错，更好地为病人服务，病理医生、临床医生的知识相互渗透结合是非常重要的。,医学生在临床课学习和实习期间乃至毕业后，都会经常接触到病理诊断，从填写病理诊断申请单、病理活检取材，对病理诊断的理解，对病理特殊检测结果的分析，手术中冰冻病理诊断，以及根据病理报告的结果进行最佳的临床处置等都需要病理与临床相结合。,本课程开设的目的是：让医学生站在临床角度来认识病理诊断过程，认识它的可靠性及局限性，同时又让学生站在病理学角度来理解病理诊断含义，以及它对临床的指导意义和价值。为将来学生毕业后，在临床医疗实践过程中，达到诊断治疗的和谐、准确，避免诊疗事故的发生打好基础。,尸体剖验活组织检查动物实验组织培养与细胞培养病理学观察、检测,尸体剖验（autopsy),意义：1、直接观察疾病的病理改变，明确对疾病的诊断，查明死因（包括司法鉴定）；2、验证和评价临床诊断和治疗，提高诊疗水平；3、积累病理资料和研究资料。（先进国家尸检率达到90%以上）,解剖前的准备工作 临床医生填写病史资料、解剖申请书（必须死者家属签字），尸体解剖一般在死亡后324小时内进行。病理医师准备好各种解剖器械物品（解剖刀、锯、固定液、消毒液、培养液等）,解剖尸体规则第一条为便利教学，提高诊疗质量，促进医学科学事业的发展，参照我国社会风俗习惯，特制定本规定。第二条尸体解剖分为下列三种。一、普通解剖：限于医药院校和其他有关教学、科研单位的人体学科在教学和科学研究时施行。下列尸体可收集作普通解剖之用：1死者生前有遗嘱或家属自愿供解剖者；2无主认领的尸体。,二、法医解剖：限于各级人民法院、人民检察院、公安局以及医学院校附设的法医科（室）施行。凡符合下列条件之一者应进行法医解剖：1涉及刑事案，必须经过尸体解剖始能判明死因的尸体和无名尸体需查明死因及性质者；2急死或突然死亡，有他杀或自杀嫌疑者；3因工、农业中毒或烈性传染病死亡涉及法律问题的尸体。,三、病理解剖：限于教学、医疗、医学科学研究和医疗预防机构的病理科（室）施行。凡符合下列条件之一者应进行病理解剖：1死因不清楚者；2有科学研究价值者；3死者生前有遗嘱或家属愿供解剖者；4疑似职业中毒、烈性传染病或集体中毒死亡者。,上述1、2项的尸体，一般应先取得家属或单位负责人的同意。但对享受国家公费医疗或劳保医疗并在国家医疗卫生机构住院病死者，医疗卫生机构认为有必要明确死因和诊断时，原则上应当进行病理解剖，各有关单位应积极协助医疗卫生机构做好家属工作。第三条解剖尸体必须经过医师进行死亡鉴定，签署死亡证明后，方可进行。第四条供普通解剖使用的无主尸体，应保存一个月后方可使用。在此一个月内，如发现姓名及通讯地点时，应及时通知尸主，在限期内前来认领。逾期不领者，在呈报主管机关或公安部门批准后，即可解剖。,第五条病理解剖科（室）只接受医疗、预防、科研、卫生行政机构和其他有关国家机关的委托进行尸体解剖。第六条在实行病理解剖时，如发现有他杀或自杀可疑时，病理解剖单位应报请公安局派法医进行解剖或由法医与病理医师共同解剖。第七条凡病理解剖或法医解剖的尸体，可以留取部分组织或器官作为诊断及研究之用。但应以尽量保持外形完整为原则。如有损坏外形的必要时，应征得家属或死者生前所在单位的同意。,第八条病理解剖或法医解剖，一般应在一个月内向委托单位发出诊断报告，如发现其死因为烈性传染病者，应于确定诊断后十二小时内报告当地卫生主管部门。第九条病理解剖应尊重少数民族风俗习惯，要积极宣传病理解剖的科学意义，提倡移风易俗。第十条死者生前有遗嘱或家属自愿供解剖者，如系自费医疗，医院可酌情补助火葬费（每例不超过四十元为限）。,第十一条凡开展病理解剖和法医解剖的单位，应建立解剖簿，登记下列事项：1尸体编号、姓名、年龄、性别、籍贯；2尸体来历；3附解剖原因；4临床诊断；5解剖年、月、日；6解剖人姓名；7解剖后诊断；8解剖报告日期；,如无法知其姓名、籍贯者，第1项可仅列编号、性别以及估计年龄，其余可填未详字样。第十二条施行病理解剖和法医解剖的单位，应将解剖尸体的情况（包括尸体解剖诊断），每年至少向其主管部门书面汇报一次。第十三条自本规则发布之日起，凡与本规则有抵触的过去的有关规定一律停止实行。,病理解剖方法和记录,1.体表检查 一般状况：年龄、性别、身长。尸冷：1115环境中，经28小时下降至 与周围环境温度相同 尸僵：死后各部肌肉渐至僵硬称尸僵。死后2小 时自下颌关节开始，渐延至颈部、躯干、上肢、下肢，持续24小时以上，以后逐渐消失 尸斑：死后血管内血液逐渐向尸体下垂部沉降，皮肤出现不规则的紫红色斑纹或斑块，一般死后 2-4小时出现，12小时后压之不退色。,2.各部位器官、组织的剖验 颈部器官、胸、腹腔解剖 脑-脊髓的解剖3.病理诊断 初步确定本例的主要疾病；分析各种病变的相互关系；初步确定本例的死亡原因；病理切片作出完整的病理诊断。,活组织检查（biopsy),局部切除、钳取、穿刺以及摘除等方法由患者活体采取病变组织进行病理检查。19世纪中叶（1854)，德国病理学R.Virchow,18211902 在显微镜帮助下，首创了细胞病理学，他认为细胞结构的改变和功能障碍是一切疾病的基础，并指出形态学改变与疾病过程和临床表现的关系。病理组织活检 迄今仍为最可靠的最常用的疾病诊断方法之一。特别是肿瘤性疾病最为可靠的诊断方法和手段。,Rudolf Virchow 1821-1902,嗜铬细胞瘤肉眼观,嗜铬细胞瘤镜下观,流行性脑脊髓膜炎,一、病理申请单的填写,患者基本资料：姓名、年龄、性别、婚否、职业 患者简要病史：要求内容完整、字迹清晰。过去诊断情况:特别是过去的病理诊断临床检查主要阳性及阴性结果等资料，以往病理检查结果；手术所见以及取材部位：一定要准确、具体！,二、取材 1.临床医师取材-要求尽可能取到典型病变部位、在允许的情况下尽量取较大或较多的组织样本。取下的病理标本应该立即置于10%的福尔马林液中固定，大标本应该作剖开固定。2.病理医师取材要求-取得的组织立即防入10%福尔马林中固定，一般都尽量早固定，特殊要求者（细菌培养、脱钙等）事先联系。取材-注意不要挤压组织刀口要锋利，大小：1.51.50.20.3cm为宜。有时特殊需要可先固定后取材。小标本要用透水的薄纸包好，并用伊红染上颜色，以免包埋中丢失。骨组织或钙化明显的标本应先脱钙处理。,冷冻切片取材 取材后应立即用液氮、或-70度冰箱保存。液氮法-组织平放于容器内（盛有液氮的小杯）组织迅速冷冻后取出用铝箔包好编号存 入液氮罐或-70度低温冰箱保存。可存 数月至数年。注意：新鲜标本不能放入-10度 冰箱缓慢冷却，否则组织内水份可被逐渐析出 结晶而破坏细胞和组织结构，影响观察。组织 块复温时，应在37度加温速融，自然复温将 造成组织破坏。,固定方法 将组织浸入某些化学试剂，使细胞内物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称“固定”。根据需要选择不同的固定液。甲醛、四氧化锇.等固定。固定时间：大多数组织应固定6-24小时，加热可使蛋白质凝固，一般不要求加热固定，冷冻切片常加热固定。,注射、灌注固定法 组织过大、整个脏器或动物的固定。肺切除标本，可经气管或支气管注入固定液。肝肾可从相应的动脉注入固定液。实验动物可通过左心室进行灌注固定，使全身各组织脏器都得到良好固定。细胞涂片的固定方法 浸入法-将新鲜而湿润的涂片直接浸入固定液内，但应注意交叉污染。滴加法-将固定液滴加在平放的玻片上，待自然挥发干燥后染色。,固定液 单纯固定液：甲醛一般为10%浓度（40%甲醛9：1混合而成）苦味酸-糖类 醋酸-保存染色体结构较好。铬酸-三氧化铬水溶液。线粒体和高尔基体 锇酸-脂类固定剂 丙酮-用于各种酶的固定 酒精-固定速度慢，固定糖原，如肝、阿米巴 原虫，尤文氏瘤糖原固定。,混合固定液 50种左右，carnoy液胞核、胞浆固定，显示DNA、RNA效 果好。也用于尼氏体固定。-,组织病理学制片技术,组织脱水、透明、浸蜡 脱水-酒精、丙酮、异丙醇。透明或媒浸-二甲苯、苯、四氯化碳、氯仿。浸蜡-石蜡 组织包埋 1.常规石蜡包埋和快速石蜡包埋 2.树脂包埋 3.塑料包埋,组织包埋 1。常规石蜡包埋和快速石蜡包埋 2。树脂包埋-电镜 3。塑料包埋-光镜、切片薄,组织切片 石蜡切片 振动切片振动切片机，将新鲜组织不固定，不冰冻切成厚20-100um切片。用漂染法在反应板进行免疫组化染色，而后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位。后固定，再按电镜样本制备超薄切片。可较好保存脂溶性物和细胞膜抗原，用于显示神经系统抗原分布。适宜免疫电镜观察:-超薄切片,染色苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin HE)细胞核：苏木精+-DNA-以离子键结合而被染色 细胞浆：蛋白质为两性物，染色与PH值密切相关伊红是酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，呈不同程度的红色。,This is the normal appearance of small intestinal mucosa,特殊染色组织染色-Masson:结缔组织、胶原、肌肉 Reticular fiber:PAS:过碘酸-Schiff染色：糖原 AB:黏液特殊病理沉积物-刚果红：淀粉样物病原微生物-六胺银：真菌 wathin-atarrg胃幽门弯曲菌内分泌细胞-六胺银,不同病理学诊断技术的应用及评价,肿瘤的诊断方面，现在许多新技术如流式细胞分析、免疫组织化学、形态定量分析、分子遗传学等技术的价值已被充分证实，为肿瘤的诊治提供了大量有用的信息，为癌症诊疗水平提高起到了很大的推动作用，但在这些检测参数的评估中，常常有明显的例外，应记住所有新技术都需要依据组织病理学诊断这个金标准去评价、认定较新的诊断方式是否更有客观性。常用的肿瘤病理学诊断技术从大的方面包括病理组织学检查，病理细胞学检查两种。,一、病理组织学检查（一）常规石蜡切片石蜡切片是病理学中最常用的制片方法，各种肿瘤病理标本福尔马林固定后，经取材再固定、脱水浸蜡包埋切片和染色等，24小时即可完成全部制片过程，3天左右就可作出病理诊断。石蜡切片的优点是取材可以广泛而全面，制片质量较稳定，阅片较容易。适用于穿刺活检、切取活检、内镜活检和手术切除标本的检查。所有手术中作过冷冻切片诊断的肿瘤组织，必须再作石蜡切片核实诊断和进一步确定组织学类型。目前为止，应用常规石蜡组织切片诊断，仍然是各种癌症最可靠、最常用的手段。,（二）快速石蜡切片 快速石蜡切片是将上述常规制片过程简化，并在加温下快速进行。现常用微波或超声波加热固定，丙酮脱水，软蜡浸蜡后，将组织包埋成蜡块再切片，每一组织的全部制片过程仅2040分钟左右。此法优点是设备简单，切片质量与常规石蜡切片近似，可适用于活检的小标本，如果组织过大，切片质量会受影响。目前也有部分医院应用快速石蜡切片作术中病理诊断，但作出病理诊断的时间比冰冻切片稍长。,（三）冷冻切片 先将需要制片的组织通过各种方法快速冷冻成硬块，然后再切片、染色。冷冻切片材料为手术中切除或活检的新鲜标本，亦可是超低温保存的新鲜组织。手术中病理诊断最主要目的是确定病变性质，为手术医生决定进一步的手术方案提供病理信息。材料可以是切除的肿块、局部淋巴结及肿瘤切缘等。,1冷冻切片技术包括有：.液化气体冷冻法：氯乙烷二氧化碳丁烷以及液氮等，将其直接喷射在组织块和切片刀上，待组织冻结均匀及切片刀冷却后立即切片，然后染色，全部过程约20分钟，由于制片质量不稳定，目前使用这种方法用于诊断的较少。半导体冷冻法：以半导体制冷台通电后所形成的温差制冷，使置于冷冻台上的组织变硬然后再切片，通常20分钟可作出诊断，这种方法成本低，较适合基层医院，但速度稍慢，冷冻效果欠佳。恒冷切片法：低温恒冷切片机是目前最先进的冷冻切片机，切片过程均在恒冷箱内进行，温度可以根据需要调节，单个组织块约15分钟可制备出病理切片，制片质量明显高于前两种冷冻制片法，而且稳定性好。,2冷冻切片诊断的可靠性：一直是困绕病理医生的重要问题，对术中肿瘤冷冻切片的病理诊断，病理报告有以下三种结果。正确诊断。冷冻切片诊断结果与石蜡切片诊断结果完全符合或基本符合，良恶性质无误，组织学类型可以有偏差。误诊：包括出现假阴性和假阳性。从国内外大量冷冻切片诊断资料看，术中冷冻切片诊断确诊率在95%99.5%。误诊病例主要为假阴性较多。不能确诊：在良恶性难辨，疑似癌或恶性待排除等不能确诊的情况下只能延迟诊断等石蜡切片结果作出确诊诊断,国内外部分单位冰冻切片诊断准确与误诊情况：301医院7190例中确诊6936例（96.47%），未确诊1855例（2.58%），误诊58例（0.95%），Roger等报告，1414例中确诊1350例（95.5%），未确诊52例（3.5%），误诊11例（0.8%）。河南省肿瘤医院302例乳腺冰冻切片，确诊292例（96.68%），误诊5例（1.66%），未确诊5例（1.66%）。温州医学院附二院1100例中确诊1085（98.63%），未确诊4例（0.36%），误诊8例（0.73%），漏诊3例（0.27%）。诸暨市人民医院1058例中确诊1034例（97.7%），未确诊16例（1.5%），误诊8例（0.75%）。天津第二中心医院1070例中确诊1045例（96.82%），未确诊14例（1.3%），误诊6例（0.56%），漏诊5例（0.47%）,3冷冻切片诊断出现误诊或不能确诊的原因冷冻切片技术本身的不足：无论什么方法制备出的冷冻切片与石蜡切片相比，其厚度、着色和清晰度等都不如后者。组织不易切全而出现细胞空隙，细胞轮廓不清晰，容易出现组织折叠和厚薄不均，染色失真等；取材局限与取材不准：一方面与手术医生切取的组织是否包含了肿瘤实质、病变组织的大小有关，另一方面与病理医生肉眼判断病变的能力和取材经验有关。术中冷冻切片病理检查时因时间关系，不允许反复取材，特别是当手术医生切取的组织未切到肿瘤实质或组织太少，或病理医生经验不足，大标本取材时，未取到肿瘤成分，这种情况下就容易造成误诊。病理医生的判断能力和经验不足或偏差：对冷冻切片观察不够仔细，遗漏可能存在的病变，或一些增生显著的病变因异型性明显而误判为恶性。,二、细胞病理学诊断 细胞病理学诊断最突出的特点是简单易行、安全、对设备要求不高、费用低，而且对患者很少造成痛苦或根本无痛苦。诊断迅速、准确性高，能够反复检查。因此在许多国家和地区已将细胞学技术推向临床诊断的前沿。,肿瘤脱落细胞的采集乳头排液或出血宫颈刮片、涂片痰脱落细胞胸腹腔积液穿刺涂片穿刺组织涂片,脱落细胞涂片的制作 标本要新鲜，实验人员收到标本后应立即制片，因故不能立即制片时应置于低温下或加入适量酒精或福尔马林短时间固定保存。涂片须厚薄适宜而均匀，涂片后待其稍干或干燥后固定,动物实验,在适宜动物身上复制某些人类疾病的模型，进行任何方式的观察研究，了解疾病的病理发展过程和发病机制，药效评价等。如：炎症、肿瘤、传染病、寄生虫等如小鼠、大鼠、兔、狗、猴、猩猩等。最近研究表明：鼠与人类共享90%以上的基因,组织培养与细胞培养,用组织或单细胞用适当培养基培养，观察组织细胞的发生发展，如肿瘤细胞生长，细胞癌变，病毒复制，染色体变异等。特点：方便地进行体外观察疾病过程，研究加以影响因素后的变化，周期短、见效快，省时间。但不能将体外研究结果与体内过程等同看待。,用组织或单细胞用适当培养基培养，观察组织细胞的发生发展，如肿瘤细胞生长，细胞癌变，病毒复制，染色体变异等。特点：方便地进行体外观察疾病过程，研究加以影响因素后的变化，周期短、见效快，省时间。但不能将体外研究结果与体内过程等同看待。,二氧化碳培养箱,如：肿瘤细胞株的建立、耐药实验、诱癌实验、基因导入、基因检测等。干细胞的定向诱导分化等。,超微结构观察,观察细胞内结构：对于细胞超微结构的研究，目前已积累了大量资料，阐明了许多过去无法了解的现象。病理学应用方面主要是有关肿瘤的研究。遗憾的是，虽然深入研究，迄今未能发现可以诊断为恶性肿瘤的超微结构特征，特别是在低度恶性或处于良恶性之间的交界性肿瘤，即使应用最先进的电镜技术，亦难以制定出鉴别良恶性肿瘤的客观标准。,在病理诊断中选择性地作电镜检查，对疑难肿瘤诊断鉴别和探讨其发生有一定帮助，尤其是在癌和肉瘤、鳞癌与腺癌以及黑色素瘤的诊断上能起一定作用。一 瘤细胞膜及其结构异常.质膜：细胞膜可足样突起，恶性肿瘤细胞发生浸润时，可伸出伪足穿破基板，插入到间质内。.微绒毛：腺上皮起源的肿瘤细胞表面游离缘常可见到微绒毛；瘤细胞表面微绒毛可出现方向杂乱，长短、粗细不一，胃癌中出现肠型微绒毛,肝细胞癌面向狄斯隙(Disses space)，表面可出现长微 绒毛，一些腺癌癌细胞内出现带微绒毛的微囊腔。.纤毛：间皮瘤、室管膜瘤细胞表面可见纤毛。也可在异常部位出现，如瘤细胞胞浆内偶尔出现纤毛。,.基板：上皮组织和间皮来源的肿瘤细胞周围常见基板。间叶肿瘤细胞中有的也可出现基板，如神经鞘瘤、滑膜肉瘤。.细胞连接:上皮来源的肿瘤常有细胞连接结构，但恶性肿瘤细胞间连接减少、幼稚化或消失，故癌细胞易发生脱落转移。例如桥粒在癌细胞间通常是减少的，也可异常增多，或成串出现形成巨形桥粒。间叶组织来源的肿瘤细胞间一般不出现连接，但少数肿瘤例外，如滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、脑膜瘤、平滑肌肉瘤等。二肿瘤细胞核超微结构异常.细胞核异型.染色质：常染色质明显增多.核仁:核仁内有核糖体的前体物质，癌瘤细胞核内不仅核仁肥大，且可有多种形式，,三.肿瘤细胞的细胞器形态及数量异常.线粒体：在涎腺甲状腺嗜酸细胞腺瘤中线粒体大量增多密集。癌细胞线粒体数量常较少，有时线粒体形态异常，如出现细长、圈状、嵴与线粒体长轴平行的线粒体以及巨大线粒体等。.粗面内质网：肝细胞癌肾上腺肿瘤及浆细胞瘤的粗面内质网最丰富。粗面内质网异常时可出现呈同心圆排列，即同心圆膜性小体，指纹样排列或呈扁池内隔离.恶性肿瘤细胞内多聚核糖体明显增加。.中间丝：界于粗细肌丝之间，直径10nm左右，可分为张力细丝、胶质细丝、神经细丝、波形蛋白细丝等。.分泌颗粒 粘液颗粒、糖元颗粒、神经分泌颗粒（NSG），神经内分泌颗粒见于APUD肿瘤，如类癌胰岛细胞瘤嗜铬细胞瘤垂体腺瘤甲状腺髓样癌神经内分泌癌以及神经母细胞瘤等,胞浆内其他结构:微管常见于胶质细胞瘤室管膜瘤神经母细胞瘤；肌原性肿瘤细胞内可见肌微丝;晶体见于腺泡状软组织肉瘤和睾丸间质细胞瘤；黑色素小体见于恶性黑色素瘤透明细胞肉瘤；低分化腺癌细胞间有原始腺腔或细胞内带微绒毛的微囊腔(胞质内腺腔)。,新技术应用,一免疫组织化学二流式细胞分析术 三 分子病理学技术 四 图像分析技术 五 激光扫描共聚焦显微镜观察,免疫组化染色免疫组织化学标记在病理诊断和临床病理的一些应用 肿瘤中相关抗原的检测：AFPCEAHCG、S-!00 TGCalcitolinPSAActin 等。内分泌肿瘤的功能分类：脑垂体、肾上腺、胰岛等 肿瘤组织中受体的测定：ERPR测定对乳腺子宫等部位的癌瘤预后的估计和化学药物的选择有指导作用,(4).组织中病毒抗原的检测：检测病毒抗原来探讨疾病的病因和发病机理，如对HBV的检测来研究肝炎肝硬化与肝癌的关系；EBV与鼻咽癌非洲儿童淋巴瘤的关系；HPV病毒与宫颈癌的关系等(5)癌基因与抑癌基因蛋白表达的测定:c-erbB-2、P53、Rb.(6)肿瘤抗药耐药基因蛋白检测:MRP1MRP3(7)细胞周期蛋白：Cyclin D1Cyclin E,流式细胞分析术（flow cytometry,FCM）,原理：将悬浮在液体中分散的细胞微粒一个一个地依次通过检测区，细胞流速可达9m/s,当细胞通过微孔与激光呈垂直交汇时就可产生相应的电脉信号，这些代表着多种荧光强度参数的电信号再经过计算机处理，得出相应的供分析使用的点图、直方图和三维结构图。,DNA定量检测技术及其应用癌前病变的DNA倍体分析：异倍体的出现是癌变的一个重要标志，应用流式细胞分析癌前病变及不典型增生细胞的DNA含量，可协助诊断和鉴别不典型增生和早期癌;实体肿瘤DNA分析与预后的关系.细胞凋亡检测术：目前检测凋亡常用的方法是DNA断点的TUNEL和ISNT法，标记DNA断裂的3-羟基末端，可用直接或间接标记法,3.癌基因定量技术：测定细胞Cyclin(周期蛋白)对细胞周期起重要的调节作用，使用流式细胞仪测定CyclinA、B、E、D等以了解这些蛋白在细胞周期活动中的变化及作用。此外还可检测有些抑制细胞分裂作用的细胞周期蛋白，如P21、P16、P18、P27等，他们在细胞周期中也起着很重要的调节作用。多药耐药基因（multi-drug resistant gene,MDR）的表达产物P-170能将抗癌药物排出细胞外，通过流式细胞仪检测可以指导临床用药。,分子病理学技术在病理诊断和预后中的应用,原位杂交（In situ hybridization,ISH）：是一种将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。PCR技术：PCR是一种体外试管内成百倍地特异性扩增某一DNA片段，其长度一般小于1Kb。在加热后使DNA双链解链之后，用降温的方法使两条单链按碱基互补原理分别与加入的一对人工合成的寡核苷酸链引物结合。在耐热的DNA聚合酶作用下反应体系中的游离单核苷酸，在引物的引导下，以单链DNA为模板，按35端方向，合成出两条新的与模板DNA互补的子链。重复上述过程，可以使模板DNA以2 n的方式扩增（n为循环次数）。,(三）原位PCR(in situ PCR)技术 实验材料：（1）悬浮细胞；（2）涂片细胞；（3）组织切片。1直接法原位PCR(direct in situ PCR):特点是使阔增产物直接携带标记分子。操作简便，特异性较差，容易出现假阳性结果，且扩增效率较低。2间接法原位PCR(indirect in situ PCR)：主要步骤：标本固定，目的是保持原有组织细胞的形态结构；渗入，即让引物核苷酸和酶等反应液进入细胞内；原位扩增；原位杂交检测，用特异性的标记探针对扩增产物进行原位杂交，然后再根据标记分子的性质用亲和组织化学方法或免疫组织化学方法显示其扩增信号。,原位杂交、PCR、原位PCR的应用：1检测内源性基因 固有基因:机体细胞基因形态学上了解很少，原位PCR的问世，对基因的定位检测提供了最敏感最有效得手段。异常或变异基因：基因突变都可以用原位PCR来进行检测和研究。2.检测外源性基因 感染基因：病毒基因现在原位PCR正广泛用于HBVHIVHPVHSV等病毒性疾病的诊断及相关肿瘤的诊断及研究。细菌基因用于某些细菌感染性疾病，如结核病及麻风病的诊断。导入基因：转基因细胞，转基因动物或接受基因治疗的患者，都可以用基因检测的手段对外来基因进行鉴别，并判断基因导入新环境后发生那些突变等。,基因和疾病,“几乎每一种疾病都牵涉到基因”“Virtually all Disease have a genetic component”引自Francis Collins 博士,人类基因工程计划发言人,美国国立卫生实验院人类基因研究所所长,基因变异与疾病,突变(Mutations)移码突变(Frameshift mutation)缺失(Deletion)插入(Insertion)基因扩增(Gene amplification)基因转位(Translocation)核苷酸非随机重复(Non-random repeat)印刻灭活(Imprinting)其它(Others),常用分子诊断技术和方法,基因扩增(放大)多聚酶联反应(PCR)联接酶联反应(Ligase Chain Reaction)DNA杂交(Hybridization)Southern 印迹法(Southern blot)免疫荧光标记原位杂交(FISH)/显色原位杂交(CISH)DNA序列测定(Sequencing)细胞遗传学/染色体核形分析(Cytogenetics/Karyotyping)流式细胞仪技术(Flow cytometry).其它方法和技术:限制性内切酶酶切片断多形性(RFLP)DNA单链构象多形性(SSCP)比较基因组杂交(Compartive Genomic hybridization),色谱核形分析(Spectral karyotype),基因扩增(放大)技术,多聚酶联反应(PCR-polymerase chain reaction,)联接酶联反应(Ligase Chain Reaction),DNA杂交(Hybridization),Southern 印迹法(Southern blot)免疫荧光标记原位杂交(FISH)显色原位杂交(CISH),荧光原位分子杂交染色体分析技术(cromomsome analysis by fluorescence in situ hybridization,FISH)可以在同一核内显示两种或多种序列，如原位杂交显带、基因定位、基因诊断、病毒插入基因组的检测、基因扩增或缺是失,提高间期胞核空间位置变化后检测的准确性,激光显微切割技术,特点：可以获得纯的细胞群或细胞材料：石蜡包埋组织切片、冷冻切片、培养细胞、细胞涂片等。应用：细胞基因突变及微卫星变易的研究；细胞基因拷贝数的变化和甲基化水平的研究 定量RT-RCR.比较基因组杂交 cDNA微阵列,分子诊断在医学上的应用,.肿瘤学.传染病学 HIV,HCV,HBC,HSV,等.遗传病学 确诊疾病，产前诊断，(卵母细胞)植前诊断.分子药理学/药理遗传学 新药发明,疗效预测,疗效判断,等.器官/组织移植 干细胞,骨髓,实体器官,等.法医学 身份认定，亲子鉴定,等.其它,分子遗传病理在临床上的应用,疾病的精确诊断和分类 肿瘤尤其是-癌症传染病 遗传病.判断预后.预测对治疗的反应.寻找治疗目标.检测残余肿块(疾病).估价肿瘤(疾病)易感素质.组织分型器官/组织移植身份认定亲子鉴定,分子遗传病理在临床上的应用,.疾病的精确诊断和分类 肿瘤，尤其是癌症 传染病 遗传病,最终诊断.伯基特淋巴瘤(Burkitts Lymphoma),最终诊断,皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T cell Lymphoma),分子遗传病理在临床上的应用,.疾病的精确诊断和分类 肿瘤，尤其是癌症 传染病 遗传病.判断预后 Her-2/neu扩增:乳腺癌 染色体1p和19q缺失:退行型少(寡)树突胶质瘤(Anaplastic oligodendroglioma),分子遗传病理在临床上的应用,抗药性(例如,金黄色葡萄球菌的mecA基因),.疾病的精确诊断和分类 肿瘤，尤其是癌症 传染病 遗传病.判断预后.预测对治疗的反应.寻找治疗目标.检测残余肿瘤(疾病),分子遗传病理在临床上的应用,分子遗传病理学的前景和方向.基因学(Genomics)基因表达构象(Gene expression profiling)/DNA 微列(DNAmicroarray)/基因芯片(Gene Chip)寡核苷酸微列 cDNA 微列 单核苷酸多形性基因组扫描(Single nucleotide polymorphism(SNP)genome scanning).蛋白学(Proteinomics)蛋白微列(蛋白芯片,Protein Chip)质谱仪技术(Mass spectrometry).肿瘤/组织微列(Tumor/Tissue Array),.生物芯片1.简介：生物芯片(biochip)又称为DNA微阵列技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA)或多肽分子甚至组织切片或者细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的最大优点在于其高通量。,DNA微阵列技术在病理诊断及疾病机制研究中的应用应用DNA微阵列揭示基因的表达谱可以提供相当丰富的信息，有助于我们寻找癌症、疾病的新的诊断方法和治疗手段。,生物芯片 1.基因芯片 2.蛋白芯片 3.组织芯片,蛋白质芯片,基本原理:将各种已知蛋白固定于滴定板滤膜载玻片等载体上,用标记了荧光素的蛋白质与芯片作用,经漂洗将未与芯片上的蛋白质结合的成分洗去,再用用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的荧光强度,分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系由此达到检测多种蛋白质及功能的目的.应用:诊断传染病肿瘤遗传病,信号传导细胞周期调控细胞凋亡神经生物学等,目的意义,组织微阵列(tissuemicroarray，TMA)也称作组织芯片，是新兴的生物高科技技术。它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列。组织微阵列为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的组织、细胞及分子水平的分析工具。,它克服了传统病理学方法和基因芯片技术中存在的某些缺陷，使人类可有效利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系，对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选等方面均有十分重要的实用价值。可以广泛地与核酸、蛋白质、细胞、组织、微生物相关技术相结合，分别在基因、转录和表达产物的生物学功能这三个水平上进行研究。组织芯片的广泛应用将会极大地促进现代医药学、基因组学和蛋白组学研究的深入发展。,1.研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系，利用TMA技术应用于肿瘤组织蛋白表达谱的研究。对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选等。2.HE染色、免疫组织化学（IHC）染色、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、原位PCR、原位RT-PCR和寡核苷酸启动的原位DNA合成（PRINS）等 3减低研究成本和提高效率：将标本集成化，实行大批量流水线检测（在TMA上检测几十例、上百例肿瘤组织所花费的时间、材料如抗体、引物等，只相当于普通组织做12例肿瘤组织所花费的时间和材料）。4实现质控的均一性（几十份几百份组织的实验过程的条件保持一致）减少实验误差。,图像分析技术在肿瘤病理诊断与研究中的应用,病理诊断和研究一般以定性或半定量描述为主，缺乏精确客观的量化指标，不同观察者之间，存在一定的主观性及误差，应用多媒体图像分析技术进行形态测量分析，使形态量化，一定程度上解决了这个问题。图像细胞术（imagecytometry ICM）,将二维平面的图形结构要素量化并进行分析则；体视学（stereology）。是由二维图形结构信息通过数学统计公式的计算来推论三维结构信息的分析法 在肿瘤诊断与研究中，图像细胞术主要测量三个方面的参数。即测量平面形态参数的ICM；测量光密度的DNA含量分析；测量呈色反应产物（包括细胞化学免疫组织化学及原位杂交）的ICM.。,图像（形态定量）分析技术 1良恶性肿瘤的区别上的应用 2肿瘤的病理分级上的应用 3参数与肿瘤预后的评价图像细胞光度技术（二）细胞核DNA倍体状态的图像分析：测量DNA 含量可作为诊断癌细胞的客观依据。具有正常DNA含量的细胞称二倍体（diploid）,而恶性细胞由于其DNA含量与正常不同则称为非整倍体或异倍体（aneuploid）.适用于各种标本，包括印片涂片石蜡切片冰冻切片新鲜及组织消化后的细胞离心标本，标本采用Feulgen氏法染色，可长期保存及根据细胞学改变选择测量对像等优点，很适合病理肿瘤研究。有人对比流式细胞术与图像细胞术，两者结果相近或后者优于前者。,激光扫描共聚焦显微镜在病理诊断中的应用,激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopeCLSM）能通过对细胞内部非侵入式光学断层对细胞或组织内部进行定位检测，并可重建三维结构模拟像直接对观察对像的三维结构数据进行定量分析。CLSM的主要结构有：计算机系统、激光照射系统、显微镜系统、X-Y平台系统、检测系统等,用于以下几方面的研究：细胞、组织光学切片，三维图像重建，并可将重见建图像进行旋转观察；对活细胞内酸碱度及细胞离子的动态定量测定观察；、细胞骨架的构成、生物膜结构、和大分子组装等的研究；细胞间通讯的研究；免疫荧光的定量分析；细胞膜流动性测定和光活化技术。,