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第十一章 酶技术,第十一章 酶技术,定义：以酶为研究对象的各种生化技术的统称。包括：酶生物合成的调节技术 酶的分离纯化技术 酶反应动力学研究技术 酶的分子修饰技术 酶、细胞核原生质体固定化技术,第一节 酶生物合成的调节,遗传信息传递的中心法则,定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,第一节 酶生物合成的调节,（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）,基因操纵子调节系统示意图,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录（-）RNA聚合酶（+）转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂,控制区 信息区,操纵子,调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。,cAMP-CRP复合物的作用示意图,启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,(二)酶合成调节的类型 1.诱导(induction)组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。2.阻遏(repression)分解代谢物阻遏(catabolite repression)：某物质分解代谢的产物阻遏某些酶生物合成的现象。反馈阻遏(feedback repression)：即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的一系列酶的量调节,所引起的阻遏作用,（三）酶合成的调节机制 1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,启动子,O,R,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,阻遏蛋白（有活性）,诱导,诱导物的选择,分为三类（1）酶的作用底物；（2）酶的反应产物；（3）酶的底物类似物：最有效,酶诱导合成的条件,（1）基因必须完整。a.结构基因改变 b.同一操纵子中第一个结构基因破坏 c.操纵基因变异 d.调节基因变异,酶诱导合成的条件,（2）阻抑蛋白本来与操纵基因的亲和力强，两者原来结合在一起，使酶不能合成；（3）在添加诱导物时，细胞所处环境中，不能有高浓度的分解代谢阻遏物或其他强阻遏剂存在，否则将无法诱导。,酶诱导合成的检测,一般通过测定酶活力的方法进行检测。胞外酶：诱导一定时间后，取培养液测定酶活力；胞内酶：破碎细胞后测定酶活力。,2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。,色氨酸操纵子酶的阻遏,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达,代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,3.分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP-CAP,P,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,使CAP呈失活状态,第二节 酶反应动力学的研究,主要包括：酶反应初速度的测定底物浓度对酶反应速率的影响米氏常数和最大反应速度的测定温度、pH、抑制剂等对反应速度的影响酶反应活化能的测定激活剂的作用抑制类型的确定,开始一段时间内反应速度几乎维持恒定，即产物生成量与时间成直线关系,一、酶反应初速度的测定,为正确测量酶促反应速度并避免干扰就必须测定反应初期干扰因素还来不及起作用时的速度，称之为反应初速度。（1）测量单位时间内底物的消耗量（2）测量单位时间内产物的生成量,测定的一般步骤,（1）选择适宜的底物；（2）确定酶反应的温度和pH条件；（3）准备就绪后，将酶液加到底物中，开始反应，计时；（4）每隔一定时间测定产物生成量；（5）作图：以反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标作图。,二、底物浓度对反应速度的影响Km和vmax的测定,1、底物浓度对酶促反应速度的影响,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,一级反应 v=k S,零级反应 v=k E,混合级反应,单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,k4,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,*当v=Vmax/2时，Km=S（Km的单位为浓度单位）*是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。,Km和vmax的测定,求Km和vmax采用直接作图法 从vS图，找出1/2 Vmax，查出SKm但S无论怎样大，也只能趋近Vmax，故1/2 Vmax不准，且点也要多。,(1).双倒数作图法（最常用）,改写M氏方程为：1/v=Km/Vmax(1/S)+1/Vmax,(2).伊蒂-霍夫斯第方程,三、最适温度、热稳定性和活化能的测定1.最适温度测定,在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固定不变的常数,在较低的温度范围内，酶反应速率随温度升高而增大，但超过一定温度后，反应速率反而下降，因此只有在某一温度下，反应速率达到最大值，这个温度通常就称为酶反应的最适温度。,2.热稳定性测定,测定方法：（1）温度不同，作用时间相同时的酶反应速度，计算不同温度下相对酶反应速度；（2）测定较高温度下，不同时间的酶反应速度。,3.活化能测定,反应活化能的一般测定方法是测定不同温度下的反应速率常数，根据阿累尼乌斯公式：lnk=lnA-Ea/RT以lnk对1/T作图，图像为直线，其斜率为-Ea/R，从而计算出Ea。,四、最适pH值的测定,pH影响酶活力的原因：过酸过碱导致酶蛋白变性影响底物分子解离状态影响酶分子解离状态影响酶的活性中心构象,酶的活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH（optimum pH）。,最适pH（optimum pH）,pH,五、酶的激活与抑制,凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）激活剂主要类别：金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：Cl-、Br-有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA,凡是使酶的必需基团或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor）。类型：可逆抑制剂 不可逆抑制剂:不能用透析或超滤等方法去除酶与抑制剂非共价地可逆结合，当用透析或超滤等方法除去抑制剂后酶的活性可以恢复，这种抑制作用叫可逆抑制作用。,抑制剂对酶作用的影响,抑制剂类型和特点,竞争性抑制剂可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂,非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂,抑制剂与酶的必须基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称不可逆抑制（irreversible inhibition）。,抑制剂与酶的必须基团以共价键结合而引起酶活力丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，称可逆抑制（reversible inhibition）。,+I,EI,ES,P+E,E+S,竞争性抑制作用,可通过增加底物浓度削弱或解除这种抑制作用。,抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。酶的活性部位不能同时既与底物结合又与抑制剂结合，因而在底物和抑制剂之间产生竞争，形成一定的平衡关系。大多数竞争性抑制剂的结构与底物结构类似如：丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。,竞争性抑制曲线,竞争性抑制中，Vmax不变，Km增大，即达到相同最大速度所需的底物浓度增多。,非竞争性抑制作用,+I,EI+S,ESI,ES,P+E,E+S,+I,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,作用特点：底物和抑制剂同时和酶结合两者没有竞争作用。酶与抑制剂结合后还可以与底物结合；酶与底物结合后还可以与抑制剂结合。但是中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活性降低。这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，这种抑制作用不能用增加底物浓度来解除抑制，故称非竞争性抑制。,这种抑制作用不能用增加底物浓度的方法来消除。,非竞争性抑制曲线,非竞争性抑制中，Vmax变小，Km不变，即在底物浓度不变情况下，降低了反应的最大速率。,反竞争性抑制作用,ESI,ES,P+E,E+S,+I,作用特点：酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。,反竞争性抑制曲线,反竞争性抑制中，Vmax变小，Km变小11111,第三节、酶、细胞和原生质体固定化技术,固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。,游离酶的缺点：,1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.分离纯化困难。,一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点,1.固定化酶(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,什么是固定化酶？,优点：(1)可提高稳定性。(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。,2.固定化细胞（immobilized cell）,固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。,优越性：(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系完成部分代谢过程。局限性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。,3.固定化原生质体,意义：(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。,固定化方法,（一）酶的固定化方法,吸附法,共价偶联法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,离子交换吸附,物理吸附法,二、固定化方法,1.吸附法（adsorption）,依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。,根据吸附剂的特点分:,1）物理吸附法（physical adsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2）离子结合法（ion binding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。,2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,1）载体：亲水载体优于疏水载体,如:天然高分子衍生物:纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,2）偶联方法：,偶联成功与否取决于：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。,常用的偶联反应有：重氮化法;叠氮法;溴化氰法;烷基化法等。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用的是戊二醛,3.交联法（crosslinking）,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。,交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。,缺点：,(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,4.包埋法（entrapment）,将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。,1）网格型包埋法（gel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：AP（过硫酸铵）Acr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED(四甲基乙二胺),2）微囊型包埋法（microencapsulation）,又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。,与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高，制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,各种酶固定化方法的优缺点比较,（二）细胞的固定化方法 1.固定化细胞的分类,2.固定化方法,1)直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。2)吸附法 3)包埋法,例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50-80加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。,直接固定法,包埋法实验：2.4%左右的卡拉胶，70 溶解,再冷却到 42,+10%左右的细菌菌体(预热到42）迅速混合均匀 4 冰箱放置大约30min 取出后切成33mm的小颗粒,一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。,（三）原生质体的固定化方法,二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征,影响酶催化活性的因素 1.构象改变或立体屏蔽以及微扰 2.分配效应和扩散限制效应,1.酶的活性：通常低于天然酶（有例外）。2.酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。如：氨基酰化酶，天然酶，70，15分钟，酶失去活性。而固定化后，70，15分钟，有80%活性。,（一）、固定化酶的性质,可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。,3.酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。4.酶的最适pH 带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。,5.酶的动力学特征,固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。,6.酶的作用专一性,与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。,（二）、固定化细胞的性质,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。（1）有活性升高的现象。（2）稳定性的增加。（3）最适温度和最适pH常保持不变。,（三）、固定化酶（细胞）的评价指标,1.酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。2.蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法)2.考马斯亮蓝法,3.偶联率及相对活力,偶联率=(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力100%相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,4.半衰期,在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。,第四节 酶分子修饰,酶在生物技术与工程中占有十分重要的地位。酶所具有的反应专一性、催化高效性及反应条件温和等优点，使其广泛应用在工业、农业、医药、环保及能源等领域。由于酶的本质是蛋白质的特点，在催化反应中受到稳定性、反应条件等制约，早期能大规模应用的酶还不够多，酶工艺也不完善。,酶在使用中的缺陷有：稳定性差、活力不够高、抗原性等，如对酸、碱、重金属、有机介质、高温等物理化学环境敏感，且活性、专一性、作用条件不能满足生产工艺要求。酶分子修饰成为酶工程中具有重要意义和应用前景的领域。随着蛋白质工程的兴起与发展，酶分子修饰与基因工程技术结合在一起，使酶分子修饰展现出更广阔的前景。,1、什么是酶分子修饰,2、酶分子修饰的基本要求和条件,3、酶分子的修饰方法,Go,Go,Go,4、酶分子修饰的应用,Go,酶分子修饰,一、什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。,酶分子修饰的意义,提高酶的活力 activity增强酶的稳定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure,二、酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例,三、酶分子的修饰方法,金属离子置换修饰大分子结合修饰(共价/非共价)侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰核苷酸置换修饰酶分子的物理修饰,（一）酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+),若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,（一）酶的金属离子置换修饰,1.金属离子置换修饰的方法,1、酶的分离纯化2、除去原有的金属离子：加入金属螯合剂3、加入置换离子,1.金属离子置换修饰的方法,金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,2.金属离子置换修饰的作用,阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶活力增强酶的稳定性改变酶的动力学特性,(二)大分子结合修饰,定义：利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。简称为大分子结合法。常用的修饰剂：右旋糖酐（dextran）、聚乙二醇（PEG）、肝素(heparin)、蔗糖聚合物（Ficoll）、聚氨基酸等。大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修饰方法。,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。,共价修饰,(二)大分子结合修饰,每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍,共价修饰,(二)大分子结合修饰,1.大分子结合修饰的方法,1、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。2、修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。,1.大分子结合修饰的方法,3、修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。4、分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,1.大分子结合修饰的方法,2.大分子结合修饰的作用,提高酶活力增强酶的稳定性降低或消除酶蛋白的抗原性,修饰的作用,1、通过修饰提高酶活力：水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更利于和底物结合，形成准确催化部位。2、通过修饰增加酶的稳定性：酶的稳定性用半衰期（指酶的活力降低到原来活力一半时所经过的时间）表示。,例如：SOD能清除体内的超氧负离子，受到医药界的极大关注。但是不容易进入细胞内，在体内的作用时间短等因素限制了SOD的应用。Beckman等利用PEG修饰SOD使其在血液中的半衰期由几分钟提高到数十小时，降低了抗原性，提高了对胰蛋白酶的消化抵抗功能。,SOD大分子结合修饰,3、通过修饰降低或消除抗原：使抗体或抗原的特定结构改变，则它们之间不再特异结合。例如：ASNase（天冬酰胺酶）能专一地催化天门冬酰胺形成天门冬氨酸及氨，是治疗白血病的有效药物。在体内作用时间短，反复注射会在血液中产生抗体，发生免疫排斥反应。用PEG修饰修饰ASNase，其抗原性可完全消除。精氨酸酶经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低。色氨酸酶经PEG修饰后，完全消除该酶的抗原性。,（三）酶分子的侧链基团修饰,定义：采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。,酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。,（三）酶分子的侧链基团修饰,催化活性/非催化活性基团的修饰,对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp,常用的化学修饰剂 一、氨基修饰剂：定义：凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物。原理：这类试剂作用于酶蛋白侧链上的氨基或产生脱氨基，或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原有的副键改变，从而改变酶蛋白的构象。主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。,氨基修饰反应,二、羧基修饰剂：定义：可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物。原理：可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的催化特性。主要有：乙醇-盐酸试剂、水溶性的碳化二亚胺等。,羧基修饰反应,碳二亚胺,三、巯基修饰剂：原理：半胱氨酸残基侧链中含有巯基。许多酶分子中存在的巯基通过形成二硫键维持蛋白质分子的三维构象，对维持酶的结构稳定性起重要作用。常用试剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等。,四、胍基修饰剂：原理：精氨酸含有胍基。二羰基化合物可与胍基缩合生成稳定的杂环。主要有：环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等,精氨酸,胍基修饰反应,五、酚基修饰剂：原理：酪氨酸残基上含有酚基。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，增加了对带正电荷底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。修饰酚基的方法有：碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。主要有：四硝基甲烷,酚羟基修饰反应,六、咪唑基修饰反应,七、色氨酸吲哚基修饰反应,八、分子内交联剂：原理：用含有双功能团的化合物，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。双功能试剂可以在酶分子中相距较近的两个侧链集团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性。主要有：戊二醛、二氨基丁烷、已二胺等。,（四）酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰),利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。,a、胃蛋白酶原的激活,（四）酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰),b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,（五）核苷酸链剪切修饰,在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能。,（六）氨基酸置换修饰,酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键联结而成的。在特定位置上和各种氨基酸是酶的化学结构和空间结构的基础。若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的催化特性，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。,例如：酪氨酰-tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所对应tRNA，若将该酶第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，经修饰后的酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍；T4-溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸换成半胱氨酸后，该半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸形成二硫键，氨基酸置换修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。,提高酶活力增强酶的稳定性改变酶的专一性,置换修饰的作用,（六）氨基酸置换修饰,Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸。修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,置换修饰的方法,化学修饰法,（六）氨基酸置换修饰,在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术,置换修饰的方法,定点突变技术,（六）氨基酸置换修饰,（七）核苷酸置换修饰,将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的方法。,（八）酶分子的物理修饰,通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。,（九）酶分子修饰的应用,酶学医药工业抗体酶研究开发核酸类酶人工改造有机介质酶催化反应,习题,1.酶固定化技术对酶的性质可能会产生哪些影响？2.酶分子修饰主要有哪些方法？修饰过程中应注意哪些问题？,