染色体涂染技术.ppt
染色体涂染技术Chromosome painting techniques,染色体涂染技术,染色体涂染技术即将整条染色体、某条染色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的DNA制备成探针，然后用荧光原位杂交的方法，将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的一种新技术。,染色体涂染技术,1.染色体DNA探针的制备；2.荧光原位杂交。,1.染色体DNA探针的制备,流式细胞分类法；克隆基因库或体细胞杂交株；染色体显微切割和PCR扩增等途径。,1.染色体DNA探针的制备,流式细胞分类法（flow cytometry）该法是用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细胞术将特定的染色体收集起来。,1.染色体DNA探针的制备,流式细胞分类法（flow cytometry）局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较多，如牛(2n=60)和狗(2n=78)的所有常染色体及绵羊(2n=54)和马(2n=64)的大部分常染色体都是端位着丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。,1.染色体DNA探针的制备,克隆基因库或体细胞杂交株 通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交细胞系制备某条染色体整个或部分DNA探针。该法特异性强，准确性高，并且可以与功能遗传学的研究结合起来，但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制。,1.染色体DNA探针的制备,染色体显微切割和PCR扩增 显微切割(microdissection)技术是在显微状态或显微镜直视下直接或通过显微操作系统对欲选取的材料进行切割分离并收集用于后续研究的技术。染色体显微切割分手工切割和激光切割法，倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。,1.染色体DNA探针的制备,染色体显微切割和PCR扩增 早在上世纪70年代，染色体显微切割已应用于多线染色体的研究，是细胞生物学常用的实验方法之一。当时由于无法直接扩增染色体DNA，所以必须在显微镜下反复切割若干拷贝的染色体，才能满足实验的要求这不仅费力耗时，而且要求实验操作人员必须具备熟练的染色体分带和鉴定经验，才保证实验的准确性。直到l989年Ludecke等将PCR扩增与染色体显微切割结合起来，从而改进了这种实验方法。对于同一条染色体，只要切割和收集5 10个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要求。从而极大地提高了实验技术的可行性和准确性。,1.染色体DNA探针的制备,通过染色体显微切割和PCR扩增制备特异性的染色体DNA探针。相对而言，该方法具有直接、准确、简便和应用范围广等优点。,2.荧光原位杂交 fluorescent in situ hybridazation,FISH,什么是原位杂交？原位杂交是基于DNA分子复制原理而发展起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在及定位。,2.荧光原位杂交,荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。,2.荧光原位杂交,基本原理：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。,2.荧光原位杂交,实验流程：FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交（染色体显带）荧光显微镜检测结果分析。,2.荧光原位杂交,优点:荧光试剂和探针经济、安全；探针稳定，一次标记后可在两年内使用；实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针当；多色FISH在同一个核中显示不同颜色可同时检测多种序列；既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以 在悬液中显示间期染色体DNA的结构。缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效 率明下降。,染色体涂染技术的应用,染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。1995年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物的染色体比对，他们运用了YAC等细胞的多种染色体作探针，以研究重组染色体的断裂点。澳大利亚Latrobe大学以染色体涂染技术探讨人的XY染色体的亲缘关系。美国Ambady等人用显微切割术和PCR扩增建立了猪第6号染色体DNA文库，寻找微星体，用于猪基因图的研究。国外实验室主 要研究不同种属的动物(包括人)或植物染色体(尤其是性染色体)的比较与进化，研究过的动物有鸡、狗、狐、猴、猫、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。,谢谢,
