《尼克酰胺NA在细胞》PPT课件.ppt

尼克酰胺（NA）在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用Role of Nicotianamine in the Intracellular Delivery of Metals and Plant Reproductive Development,Michiko Takahashi，Yasuko Terada，Izumi Nakai Laboratory of Plant Biotechnology,University of Tokyo,Japan Department of Applied Chemistry,Science University of Tokyo,Japan The Plant Cell,Vol.15,12631280,June 2004,1 Introduction 2 Methods 3 Results 4 Discussion,1 Introduction,1 尼克酰胺（Nicotianamine，NA），是一种金属螯合剂，普遍存在于高等植物中，NA可螯合金属阳离子。研究认为NA在植物体内Fe和其他金属的运输过程中起作用。NA也可能与Fe（）作用保护细胞免受氧化胁迫的伤害。但是，在高等植物中NA准确的作用仍不清楚。,2 尼克酰胺氨基转移酶（Nicotianamine aminotransferase，NAAT）催化NA的氨基转变，在禾本科植物中，NAAT是获得Fe所必需的。NAAT为禾本科植物所特有。,3 麦根酸类植物高铁载体（Mugineic acid family phytosiderophores，MAs），由禾本科植物根系分泌，它是一类低分子量的非蛋白氨基酸，可溶解土壤中的Fe，是天然的Fe螯合肽。NAAT是MAs合成过程中的关键酶(Fig 1)，催化NA的氨基化，是MAs生成过程中的一个基本媒介，MAs只有在禾本科植物中产生。注：在缺铁胁迫下，禾本科植物根系分泌出MAs，活化土壤中难溶的三价铁化合物，然后在专一的转运蛋白的作用下将Fe3+-MAs 转运进胞质中，从而被植物利用。,4 MAs的生物合成途径,为了研究非禾本科植物中NAAT产生异常的原因，把包含花椰菜病毒的35S启动子与hvnaat-A基因编码区结合的载体转入烟草（产生NA但是不产生植物铁载体），表达NAAT基因的转基因烟草植物（naat烟草）的幼叶有网纹状失绿症，花的形状异常且不育，naat烟草可产生大量的NAAT，从而使得NA短缺。本文描述转基因烟草表达大麦NAAT基因和在植物中NA消耗的表型，并试探就NA在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用。,2 Methods,1 二元载体构建：缺铁大麦根部中分离hvnaat-A cDNA 在pUC118菌株SmaI位点克隆pUC118-hvnaat-A用XbaI 和SacI进行融合克隆在pIG121Hm 菌株中。,2 植物材料和生长条件：1）通过三亲株交配二元载体pIG121Hm-hvnaat-A 被引入到根瘤农杆菌株C-58烟草中进行转化和再生离体烟草腋芽T0嫁接到nas烟草上收获naat烟草T1的种子在nas烟草上继续嫁接获得T2。2）Naat烟草（T2），nas烟草，野生型烟草和对照烟草生长在装有蛭石的盆里，条件为25C(day/night)，自然光照，每天用稀释1000倍的Hyponex 营养液浇灌植物，培养后作为实验材料。注：Nas烟草也是转基因植物，是使用具有花椰菜病毒35S启动子-hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株转化而成，并被证明超表达NAS（nicotianamine synthase）基因。,3 DNA凝胶电泳分析：DNA的提取分离电泳扩增杂交拍照4 RNA凝胶电泳分析：RNA的提取变性电泳扩增杂交拍照5 尼克酰胺氨基转氨酶（NAAT）的分析：用HPLC分析6 叶片的显微结构和超微结构观察：环氧树脂切片法7 金属浓度的测定：发射光谱仪测定8 金属在叶片中的分布：同步加速器诱导辐射X-射线荧光光谱仪（XRF）观察,9 NA的提取和分析：用HPLC进行定量分析 10 失绿叶叶绿素的测定：用SPAD-502叶绿素仪测定 11 花型异常的逆转实验：离体腋芽用五个溶液处理：(1)0 M NA+20M 柠檬酸Fe(III)；(2)20M NA+20 M FeCl3，(3)20M NA+20M FeSO4，(4)20M NA+20M柠檬酸Fe(III)，(5)100M NA+20 M 柠檬酸Fe(III),12 Naat烟草在nas烟草上的嫁接：以nas烟草为砧木，去除叶子，把naat烟草嫁接于上(Figure 9A)。进行两次嫁接试验以获得足量的种子。最后，再嫁接离体烟草（T2naat烟草）进行分析。,3 Results,1 大麦naat-A基因在烟草中的整合及其表达,2 转基因烟草（naat烟草）的表型具失绿症,幼叶失绿症是植物金属缺乏的普遍症状。因此，作者通过电感耦合等离子发射光谱仪测定了naat烟草和对照叶片中的四种金属（Cu、Fe、Zn和Mn）的浓度和分布。,3 叶片中金属的浓度和分布,naat烟草叶片中金属水平的降低表明植物内部金属的运输已经改变。因为NA是NAAT的酶作用物，可以想象NAAT的大量产生消耗了这个部位的NA，内源NA的短缺导致naat烟草内部金属的运输产生缺陷。为此，作者测量了naat烟草和对照烟草叶片的内源NA。,4 naat烟草中NA的浓度,5 NA-Fe处理失绿症被逆转 为了验证naat烟草的失绿症是由于NA的短缺所造成的，供给naat烟草Fe或Fe+NA。离体的naat烟草用以下五种溶液处理：（1）FeCl3，（2）FeSO4（3）柠檬酸铁（4）FeCl3+NA（5）FeSO4+NA,Fig6 naat烟草失绿症的逆转实验,(D)SPAD values and concentrations of metals in young naat tobacco leaves treated with the five solutions.Fig6 naat烟草失绿症的逆转实验,上述结果显示虽然NA和柠檬酸盐可促进Fe向幼叶运输，但只有NA促进Fe向失绿区运输。用柠檬酸铁处理的幼叶的SPAD 值比用FeSO4、FeCl3的高，这个结果也表明，在螯合剂（NA和柠檬酸盐）缺乏的情况下，Fe的运输很小。再者，用含有NA的铁盐溶液处理的幼叶Cu、Zn、Mn的浓度也很高，这也表明NA也促进这些金属的运输。,因为只有NA-Fe溶液逆转了naat烟草的失绿症，使用59Fe去探究NA是否促进叶内Fe的运输。用NA-59Fe或者不加NA的59Fe处理离体的naat烟草腋芽，处理6h后，叶片中的59Fe通过放射能照像可显示出来（Fig6E）。,(E)Uptake and distribution of 59Fe in naat tobacco leaves treated without NA（-NA+59Fe)or with NA（+NA+59Fe）for 6 h(analysis performedin duplicate).Fig6 naat烟草失绿症的逆转实验,6 不正常的花型和不育1）野生型与对照烟草表型：五个花瓣，花色粉红，花粉在开花以前释放，圆锥花序或聚伞形花序顶生，孢蒴卵形。2）Naat烟草表型：有两种类型的异型花。Type-I 的花与The type-II 的花。,1）Type-I 的花：开花早，花蕾形状异常，烟草的第一个花蕾最不正常，并且 type-I的花比野生型的花有更大更厚的萼片。A 放射花瓣，花瓣丝状。B 花器官异常：花瓣状萼片、雄蕊，花瓣与花丝融合 C 花冠开裂 D 花器官数量不正常：雄蕊、花瓣和心皮 数量不正常（多或少）E 混合花：两个花共有萼片，或几个特征的混合。,6 不正常的花型和不育Figure 7.Inflorescences of Wild-Type Tobacco and Type-I naat Tobacco.,2）type-II 的花：发育明显不同于type-I 花，开花晚，type-II的花与野生型的花有一些相似的特征，有正常花型，萼片、雄蕊、花瓣颜色相近，并且花粉囊产生少量的花粉。,Figure 8.Inflorescences of Wild-Type Tobacco and Type-II naat Tobacco.,在 naat 烟草中，两种类型的花产生的花粉数量少，花粉在花开放几天后释放。花粉粒没有充满花粉囊，花粉粒形状像箭头，花丝是粉色而不是白色。与野生型烟草相比，在naat烟草花的花粉囊的横向部分显示有少量的花粉，这些花粉没有发育。另外，畸形的雌蕊或长或短，且经常观察到柱头形状不规则，所有的 naat烟草植物 的叶表现为失绿症且不育。,作者通过野生型烟草和naat 烟草杂交来探究生殖器官不育的可能原因。野生型花粉被涂到naat烟草的柱头上，或者naat烟草的花粉被涂到野生型花粉的柱头(Table1)。,杂交结果：野生型烟草雌蕊naat 烟草花粉：孢蒴中的种子量少，但都成熟了。相反，野生型烟草花粉naat 烟草雌蕊：产生11个孢蒴，只有一个有少量种子。这些种子小而轻且为棕色。这表明naat 烟草的雌蕊和雄蕊都有完成受精的能力。但是，在naat 烟草中花粉的数量不能有效的完成生殖，而且naat 烟草的雌蕊由于缺少NA使得金属供应短缺，故不能产生成熟的种子。因此，naat 烟草的不育出现了三个结果，（1）花粉产量少，（2）花粉囊开裂晚，（3）受精之后卵不成熟。,7 生殖器官形态异常通过NA处理被逆转 为了探究内源NA短缺是否导致花序的形态异常，与Fig6A的描述的方法相同，除了改变NA的浓度，供给naat烟草NA，离体naat烟草用五个溶液处理(Table 2)100MNA和20M柠檬酸铁可逆转这种形态异常,A 20M柠檬酸铁 B 100MNA+20M柠檬酸铁,8 通过嫁接育性被恢复（Fig 10）为了检测内源NA短缺是否会导致不育，把naat烟草嫁接到野生型烟草上或者转基因植物nas烟草上（超表达大麦烟碱酰胺合酶基因HvNASl）naat烟草嫁接到野生型烟草上后尽管幼叶的失绿症被恢复，但育性不能被恢复；花粉囊部分正常，但种子不成熟（文中没有显示数据）。嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性，且叶片没有失绿症。,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,Figure 10.Recovery from Sterility by Grafting.,由上图可知嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性，且叶片没有失绿症。另外，大多数花粉囊正常，粉红色的雄蕊花丝逆转为白色，花粉粒完全发育，种子成熟。然而，多数种子发育不完全，且种皮皱缩，成熟种子的数量下降。从嫁接植物获得的成熟种子发芽正常，但是幼苗的叶片有失绿症，花序形态不正常且不育，(数据没有显示)。说明育性与NA有极大的关系。,9 嫁接在nas烟草上的naat烟草各器官的金属浓度（Fig11）,这些结果表明，把naat烟草嫁接在nas烟草上后可提供naat烟草NA，因此naat烟草花的Fe、Cu、Zn都有明显的升高。,10 NtNAS表达(Fig12)RNA凝胶电泳分析探究了在烟草花中的NAS表达（Figure 12）。本文分析了开花第一天成熟花蕾的四种花器官（花瓣、花丝、雌蕊、花粉囊）。NtNAS 在所有花器官中都得到了表达，这比表明花序中产生的NA是正常花发育所要求的。尤其，NtNAS在雄蕊花丝中的高度表达表明在运输金属给花粉囊的过程中NA具有重要作用。,4 Discussion and possible conclusion,1 naat烟草的表型与NA有关 表达大麦naat-A基因的naat 烟草幼叶具有明显的NAAT活性，这导致NA在这一部位被严重消耗。因此，内源NA在naat烟草中没有被检测到，而在对照中含量显著。这表明naat 烟草的表型主要是内源NA缺乏的结果。,2 NA是Fe在叶脉间以及叶脉到交错区运输所必需的(1)在naat烟草幼叶的四种金属，尤其是Fe和Cu的浓度比对照烟草叶的低。再者，在对照烟草叶中，Fe主要分布在叶脉和幼叶的失绿区，相反，在naat烟草中，在叶脉只有少量的Fe，在失绿区Fe的数量极少，这个结果表明，naat烟草幼叶缺铁，故可得出结论，naat烟草幼叶失绿症是由于运输到叶片的Fe不足所致，尤其在失绿区。,(2)单一用Fe处理naat烟草，失绿症不能逆转，柠檬酸铁处理增加了幼叶的Fe含量，但是也不能逆转失绿症，表明柠檬酸盐可运输Fe到幼叶但是不能到达失绿区。Fe+NA的处理增加了Fe的浓度并且逆转失绿症。添加外源的59Fe和NA时，59Fe立即被运输到naat烟草幼叶的叶脉和失绿区。这些结果表明NA加强了Fe向幼叶叶脉和失绿区的运输。,(3)添加NA的溶液处理幼叶也增加了Cu和Zn 的浓度，表明NA也促进这些金属向幼叶运输。在naat烟草中的四种金属浓度，在幼叶和花中，下降的顺序都相似，依次为Mn ZnFeCu。在naat烟草中金属浓度的下降可归于内源NA的亏缺。,3 NA是生殖生长和受精必需的 100MNA+柠檬酸铁的处理，可克服花形态异常、花粉成熟缺陷和花粉囊晚开裂。如果在某一部位NAAT没有消耗NA，浓度小于100M的NA可能会逆转花的形态异常。因此，低浓度的NA影响花的形态。由此可得出一些重要的结论：正常花发育比正常的叶发育要求更高的NA浓度。在生殖时期柠檬酸盐不能代替NA，也不能作为Fe养份从幼叶叶脉转运到失绿区。NA和Fe都是花正常发育所必需的，并且同时添加NA和柠檬酸铁对正常的花发育是有效的。Cu和Zn也参与正常的花发育。,嫁接在野生型烟草上的naat烟草可以逆转失绿症和花型异常，但是不能逆转不育。嫁接在nas烟草上的naat烟草可逆转幼叶的失绿症、花型异常、花粉成熟缺陷、花粉囊晚裂和不育。因为野生型烟草产生的NA比nas烟草的少（数据没有显示），可能是野生型烟草产生的NA的量不能有效补偿NAAT消耗的内源NA，从而没有足够的NA运送到种子。嫁接在nas烟草上的naat烟草花的Fe、Cu、Zn的浓度都增加了，且nas烟草花中的Fe、Cu、Zn比野生型的高。但nas烟草中Cu的浓度不高，表明NA可能参与Cu的动态平衡。嫁接试验的结果表明，种子成熟比叶和花的正常发育需要的NA多，而且NA影响花中的金属浓度。这些结论表明NA是正常花序形成、正常花粉产生和种子成熟所必需的。,4生殖时期金属的重要性 Fe、Cu、Zn、和 Mn在植物生殖阶段是很重要的，因为在这个时期，这些金属是许多关键蛋白的组分。在naat烟草中雌蕊长度异常可能是由于Fe缺乏导致酶合成紊乱所致。,5 NA充当金属载体 naat烟草中的嫁接实验和金属浓度显示NA促进Fe、Cu、Zn向花器官和种子运输。花器官中NtNAS的表达也表明NA促进金属向花序运输。尤其NtNAS 在雄蕊花丝的表达说明花粉囊花粉的成熟需要NA来运输金属。在幼叶和花中，柠檬酸盐不能代替NA。这些结果表明，NA通过存在于幼叶、花序和种子中特异的NA-金属载体运输金属到生殖器官细胞。,6 NA可能影响Zn-指蛋白的作用 Naat烟草的不育可能与这些Zn指蛋白有关系，由于NA的短缺而导致缺Zn，影响Zn指蛋白的作用，从而导致不育。另外，如果NA作为细胞间金属载体而起作用，NA的缺乏可能抑制Zn到蛋白质的准确转运或者抑制Zn从蛋白质上脱离，FIL是参与形态发生的Zn指蛋白之一，FIL是决定花正确数量和位置的关键蛋白。Naat烟草的花表型异常可能与FIL的正常表达有关。NA和EDTA一样，是金属的螯合剂，可能是通过NA供应或者去除Zn来调节Zn指蛋白。这种可能性表明NA影响细胞内转录因子的相互作用。,7 NA影响Fe结合蛋白的作用 NA可能调节Fe结合蛋白中的Fe，它主要在雌配子体的中央细胞、胚乳的起源中表达，它的DNA糖基化结构域有一个(4Fe-4S)2+。胚乳基因和种子育性需要Fe结合蛋白。NA也可能影响开裂。缺铁花的花粉囊正常开裂，即使有少量花粉。相反，由于需求茉莉酸，naat烟草延缓花粉囊开裂。因为丙二烯氧化合酶是茉莉酸生物合成的一个关键酶，此酶有亚铁血红素-Fe，它可能受NA影响。折中一下，NA可能直接影响花粉囊壁的干燥。,总之，我们展示了NA的各种作用，尤其是生殖阶段的作用。长期以来，已经假设NA是Fe、Zn和Mn经由韧皮部进行再分配所必需的，也是Cu在木质部进行运输所必需的。这个研究显示在金属转运过程中NA的作用是幼叶正常作用、生殖器官发育和能育性所必需的。另外，我们也指出NA可能是细胞内调节金属结合蛋白（诸如Zn指蛋白）所必需的。,请大家点评，谢谢！,