一节根癌农杆菌Ti质粒.ppt

第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,Ti质粒的发现历史1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒.最初的发现和命名是1907年,Smith 和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱发形成的.,Ti质粒的遗传特性及类型,Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为9.51071.6108，大小为180250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒结构特性均有差别。根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。,Ti质粒的基因位点及其功能区域,Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、Vir D、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。,LB,RB,Ti质粒介导基因转化的原理,1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、-羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIR A蛋白传递给VIR G，VIR G激活其它vir 基因(virB、virC、vir D、virE)表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。3.T-DNA单链分子释放：virD 基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIR D2蛋白共价结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。,Ti质粒介导基因转化的原理,5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子,在RB序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。6.T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。,信号受体（VIR A）,酚类物质诱导信号,VIR G,RB,LB,转移到寄主细胞,整合到植物染色体中,T-DNA单链分子释放,VIR G激活virB、virC、virD、virE、virH表达,VIR D,植物伤口,诱导信号,信号传递,诱导表达,VIR D2、VIR D4、VIR B、VIR E2等,土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制,酚类物质,VIR A,由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。,一、Ti质粒的改造(一)Ti质粒1.定义 是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA大分子，其大小为180-240 kb。2.种类 2.1 根据冠瘿碱的种类不同 章鱼碱型(octopine);胭脂碱型(nopaline);农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)or琥珀碱型(succinamopine),第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(一)Ti质粒2.种类 2.2 根据功能区段不同 基因转移T-DNA区(transferred DNA region)：与基因转移相关 毒性区,即Vir区(Virulence region,Vir):激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区 接合转移区(region encoding conjuation,Con)调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移 自我复制区(origin of replication,Ori)调控Ti质粒自我复制,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(二)天然Ti质粒存在的缺点1.缺点 野生型Ti质粒分子十分巨大；野生型Ti质粒分子一般都为180-240 kb,几乎无法进行基因工程的操作，所以应去除一切不必要的大片段DNA。限制性内切核酸酶位点众多；Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用的单一限制性内切核酸酶位，因此很难通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因.T-DNA区段内含有许多编码基因；植物生长素合成酶基因,细胞分裂素合成有关酶基因等.在大肠杆菌中不能复制。,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(二)天然Ti质粒存在的缺点 2.改造 删除T-DNA左右边界中的tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,构建所谓的“卸甲载体”；引入大肠杆菌的复制起点和选择标记基因,或将Ti质粒的T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒当中,形成植物基因转化载体系统,从而使通过Ti质粒的基因重组成为可能并有利于转基因植物的筛选；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆和操作；,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,引入植物基因的启动子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在植物细胞内能正确高效地转录表达；除去Ti质粒上的其他非必需序列，以最大限度地缩短载体的长度。研究表明,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性,因此,可以先将T-DNA的片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的Ti质粒上.中间载体:带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体;受体Ti质粒:接受中间载体的Ti质粒.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(三)御甲载体定义:无毒的(non-oncogenic)Ti质粒载体,又称onc-载体。野生型Ti质粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作为基因转化的载体，必须切除T-DNA中的onc基因，即解除其武装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失的T-DNA部位通常被大肠杆菌中的一种常用质粒pBR322取代.这样任何适于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段,都可通过pBR322质粒DNA与卸甲载体的同源重组而被共整合到onc-Ti质粒载体上.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,二、Ti中间表达载体的构建中间载体 定义:是指在一个普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适的T-DNA片段面构成的小型质粒。中间载体从功能上可分为两大类:1.克隆载体:复制和扩增基因 2.表达载体:适于在受体细胞中表达外源基因的载体 Ti中间表达载体结构区包括:选择标记基因区域;目的基因区域 每个区域由启动子、基因和终止序列组成.,二、Ti中间表达载体的构建(一)启动子及调控序列 经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因的转录与表达，其先决条件在于必须要有合适的启动子和调控序列。真核生物基因调控序列中，大多数都具有“TATA”框，位于距离转录起始点约30个核苷酸的上游区域，上游DNA的序列成分如“CAAT”(在上游-80-70bp处)也普遍存在于许多真核生物基因的启动子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，从而使基因在转录过程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信号。,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,由AATAAA编码的mRNA序列AAUAAA的作用是发出信号，让核酸酶在此序列下游10-15bp 处切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在切割点的3端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA的3端结合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护mRNA的作用.CaMV35S启动子Ubiquitin启动子,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,二、Ti中间表达载体的构建(二)嵌合基因的构建嵌合基因:来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在一起而构成的基因.完整的嵌合基因:完整,正确的可读框,能正确表达,3端的终止信号.“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。,三、Ti共整合转化载体的构建共整合载体定义 指中间载体与改造后的受体Ti质粒之间,通过同源重组所产生的一种复合型载体.(一)Ti共整合载体的特点Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是御甲Ti质粒组成.农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低.必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测构建是比较困难.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,三、Ti共整合转化载体的构建(二)Ti共整合转化载体的类型和构建策略 基于中间载体与受体Ti质粒重组序列的不同,共整合载体可分为以pBR322序列为同源序列的转化载体系统和基于左边界内部同源区(LIH)的转化载体系统,即SEV系统.1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略 此类载体系统的典型特点是在卸甲质粒的T-DNA区引入了pBR322,而中间载体是pBR322质粒或衍生质粒,二者之间通过同源重组实现目的基因及选择标记基因与卸甲Ti质粒的整合,进而以顺式方式将基因转化到植物细胞中去.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略中间载体导入农杆菌pBR322及由其衍生的质粒为接合缺陷型,所以它们进入到农杆菌菌株中必须要有协助质粒,在协助质粒的动员下转移到农杆菌中.三亲杂交法:即将分别含有中间表达载体,协助质粒,受体质粒的菌液混合培养,在混合培养过程中,通过杂交使协助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中,然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略(2)中间载体与受体Ti质粒的同源重组 pGV1103中间表达载体导入农杆菌后,由于两种质粒中都带有pBR322同源序列,因此少部分质粒发生重组和交换,使少数中间载体整合到pGV3850的T-DNA区域内,形成一个大的共整合载体.没有被整合的中间表达载体由于不能在农杆菌中复制,它将会随着农杆菌的分裂增殖而自行消失.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择通过pGV3850和pGV1103质粒同源重组形成的共整合载体能够不断复制和增殖,整合在Ti质粒中的中间载体随同Ti质粒得岂到复制和增值.中间载体所带有的抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表达.此时含有共整合质粒的农杆菌将表现出中间载体携带的抗性标记,从而在含有相应抗生素的培养基上得到生长和筛选.未发生重组的pGV3850,pGV1103等均不能生长.含有共整合质粒的根癌农杆菌即可用于植物的转化.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择整合后的Ti质粒含有重复的pBR322序列,此重复序列在农杆菌转化植物细胞的过程中,与目的基因及选择标记基因一起被整合到植物染色体组上.但这种重复的序列有可造成基因的进一步重组及重排,从而影响外源基因的表达.因此,在对pGV3850系统进行改进的基础上,获得了pGV2260载体系统.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择pGV2260系统:来自章鱼碱型Ti质粒的pTiB6S3,整个T-DNA序列连同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。与pGV3850的区别在于pGV2260系统的中间载体必须在外源基因两侧连接25bp末端序列.共整合发生后,pGV2260系统中的pBR322重复序列在25bp末端序列以外,不会随T-DNA一起整合到植物染色体中.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,2.SEV系统的构建1985年美国孟山都公司的Fraley等建立了另一种共整合载体,即拼接末端载体(split-end vector,SEV)系统即T-DNA边界拼接系统,也因为它的两个“左边界内部同源区”(left inside homology,LIH)序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,2.SEV系统的构建构建过程:(1)SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3的突变体.它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分被称为LIH,即左边界内部同源序列.该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其他正常的功能基因,同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因(Kanr).,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(2)SEV中间载体是pMON200.它含有一个胭脂碱合成酶基因,一个在细菌里编码的壮观霉素抗性基因(Sper),链霉素抗性基因(Strr)及在植物中作选择标记基因的新霉素磷酸转移酶基因(Npt).此外,它还含有一个多克隆位点(MCS),可以方便地插入外源基因.更为重要的是它具有与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR.从pMON200衍生出的一个新的质粒pCIT30具有更理想的特性.质粒pCIT30中,潮霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,并且引入了一个cos位点和多克隆位点.在噬菌体包装系统中可在cos位点上插入25-40kb的植物DNA,不需要额外的亚克隆步骤.多克隆位点上具有克隆和释放插入DNA所需要的限制酶酶切位点。该载体还具有T7和S6细菌噬菌体启动子，它们用于转录染色体步移中的末端特异性RNA探针.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(3)通过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌后,由于它之间都具有LIH同源序列,即可发生同源重组,形成SEV的共整合载体.SEV包含有分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因,成为一个完整的非致瘤性Ti质粒.由于中间载体带有抗性嵌合基因,因而转化的植物可以直接进行筛选.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(3)SEV系统与pGV3850系统的比较相同点:两者都是通过受全Ti质粒与中间载体同源重组而形成的,故同属于共整合载体.不同点:它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同.pGV3850的左右边界(TL,TR)在一个受体Ti质粒上,而SEV来自两个质粒,即TR来自中间载体.同源序列不同.pGV3850重组的同源序列是pBR322,而SEV是LIH.SEV是更有效的共整合载体.pGV3850共整合载体转化的植物中也带有重复的pBR322序列.此重得序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响,而SEV系则排除了这种可能,所以更为有效.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,四、Ti双元转化载体的构建双元载体(binary vector)定义:是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统.由于T-DNA与Vir基因分别位于两个独立的质粒上,Vir基因是通过反式激活的方式促成T-DNA的转移,故称为反式载体.通常含有T-DNA序列的穿梭载体用于携带嵌合基因,而含Vir基因的Ti质粒作为辅助质粒激活T-DNA的转移。,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(一)Ti双元转化载体系统的构建原理Ti质粒上的vir基因与T-DNA具有反式互补作用,即Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。根据这一原理可以使T-DNA与Vir区处于不同复制子或不同的Ti质粒上,同样可以激活T-DNA转移,使插入到T-DNA区的外源基因导入植物细胞中;双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点(ori),从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区.它能够在任何农杆菌寄主里自发复制,这意味着所有的农杆菌菌株不论带有Ti质粒还是Ri质粒,不论它是武装的，还是解除武装的，都能导入中间表达载体而成为双元表达载体，寄主仅需要提供一套完整的Vir基因.,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(二)Ti双元转化载体系统的特点由两个彼此相容的Ti质粒组成：1.转移载体质粒 是T-DNA缺失的突变型质粒,类似于共整合表达系统中的卸甲质粒。2.穿梭质粒,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,穿梭质粒的特点：(1)具有PK2质粒的复制功能，可以在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制，并且与Ti质粒是相容的;(2)具有Ti质粒的左右两侧或右侧的边缘区序列，使DNA可以转移到植物细胞；(3)边缘区序列内包含植物选择标记嵌合基因，用于转基因阳性株的初步筛选；(4)带有抗生素基因,一般是Kanr基因,可以作为细菌转化子的选择记号,第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(三)共整合载体系统与双元表达载体系统的比较 两个系统在构建思路上,一个是应用了Vir基因对T-DNA的顺式作用,一个是应用了反式调控,二者之间存在较大的差异.(1)双元表达载体构建简单;双元表达载体具有双复制位点;双元表达载体的接合频率更高;双元表达载体在鉴定上更为容易;双元表达载体的稳定性不如共整合载体.,