《试管动物》PPT课件.ppt

第四节 试管动物受精(fertilization)是指由雌、雄个体产生的卵子(ovum)和精子(sperm)相遇、融合以及它们的核质结合为合子的过程。体外受精(in vitro fertilization,IVF)：是指把成熟的卵母细胞或把未成熟卵母细胞(oocyte)在人工创造的体外培养系统中体外成熟(in vitro maturation,IVM)后，与体内或体外获能(in vitro capacition)的精子在体外条件下完成受精过程，形成受精卵(合子)的过程。,显微受精(microferti1ization)：是指借助显微操作仪将精子或精子细胞直接注入卵母细胞内来实现受精的过程。将精子注入卵母细胞胞质的显微受精称为卵胞质内受精（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）将精子注入卵周隙中的显微受精称为带下受精（subzonal insemination，SUZI）。试管动物：是指利用卵子和精子的体外受精或显微受精、受精卵体外培养(in vitro culture,IVC)和移植获得的各种动物。,一、体外受精研究简史及意义（一）体外受精的研究简史哺乳动物体外受精的研究已经有l10多年的历史。德国科学家Schenk.SL(1878)最早将家兔和豚鼠排卵前的卵母细胞与附睾精子放入子宫液中培养，发现可使卵丘细胞分散、第二极体排出。当进步培养时，还注意到有卵裂发生。1951年，张民觉和Austin分别在兔子和大鼠同时发现了哺乳动物精子的获能现象，由Austin定名为获能，从此开创了哺乳类体外受精研究的新纪元。,1954年，Thibault等用从母兔子宫内回收的精子，获得了兔的体外受精成功，张民觉于1959把体外受精的兔卵裂卵移植给受体母兔，获得了世界上第一胎体外受精的哺乳动物“试管小兔”，从而拉开了人工制作“试管动物”的帷幕。显微受精最早报道于日本的Hiramoto(1962)，他将海胆精子注射到海胆卵，但未能激活卵母细胞。在哺乳动物，精子注射试验首先在啮齿类中进行，1976年，Uehara等将仓鼠和人精子注入仓鼠卵母细胞质中，观察到精核能够去致密并可以发育形成雄原核，但未观察到卵裂。,1988年，Hosoi和Mann分别报道了兔单精子胞质内受精和小鼠单精子带下受精成功，并获得后代。该项技术已先后在多种动物取得成功。1990年，世界上首例ICSI(Lippi等)试管婴儿和SUZI(Fishel等)试管婴儿先后诞生。目前，人的显微受精效率居动物显微受精首位，人的ICSI的受精率高达6070，胚胎的着床率也达到20或更高。,（二）体外受精的研究意义在基础研究领域，体外受精能够再现体内受精过程，有利于揭示受精的本质和机理，而且有助于研究胚胎的分化和发育。借助体外受精技术，还可以观察到在体内难以看到的细胞融合现象，有利于阐明细胞膜融合的机理。体外受精可以作为生物模型而有助于发育生物学、遗传学、分子生物学以及基础医学等相关学科的研究。,在应用研究领域，体外受精可用于治疗人类不孕症，使患双侧输卵管阻塞或排卵障碍等不孕症的妇女,通过体外受精获得自己的子女。在胚胎移植技术日益走向商业化和胚胎工程技术迅猛发展的今天，提供大量的良种胚胎己成为亟待解决的问题。通过成熟的诱导排卵、卵巢卵母细胞的体外培养、精子的体外获能、成熟卵的体外受精和受精卵的体外培养与保存等一整套体外受精技术的开发利用和进一步完善，可以人工生产大量胚胎，为实现胚胎的工厂化生产提供了可能，从而为胚胎移植业开辟胚胎来源。,体外受精技术同胚胎分割、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定、胚胎克隆和基因导入等生物工程技术相结合，可以为家畜的部分遗传性状改进和培育出遗传上全新的品种开辟道路。由于珍稀濒危动物的繁殖力低下，体外受精可以使不同栖息环境的同种动物得到繁殖机会，还可以将体外受精后的胚胎移植给血缘关系相近的物种，可增加濒危动物的个体数，将体外受精后的濒危动物胚胎冷冻保存，可以起到保存种质资源的作用。,此外，采用体外受精技术还可以早期利用优良幼龄母畜的卵子，从而缩短世代间隔，提高良种母畜的繁殖效率。显微受精是借助显微操作的体外受精技术，这一技术对于提高优良种公畜的利用率和治疗男性不育症方面具有重要的实践意义，尤其在野生动物的遗传资源保存和保护以及挽救繁殖力低下的珍稀动物方面具有重要的现实意义和应用前景。,二、体外受精体外受精技术主要包括成熟或未成熟卵母细胞的采集，未成熟卵母细胞的体外成熟培养，精子的体外获能，成熟卵母细胞与获能精子的体外受精，受精卵的体外培养和移植等一系列步骤。显微受精则需要借助显微操作将精子或精子细胞直接注入卵母细胞内而完成体外受精过程。,（一）卵母细胞采集1.卵巢卵母细胞的采集(1)离体卵巢卵母细胞的采集1)抽吸法 2)切割法3)剥离法：取完整的圆形卵泡，放到加有培养掖的平皿中，切开卵泡，可见到卵泡液自卵泡中流出并带有卵母细胞。此法程序麻烦，但对卵丘-卵母细胞复合体的损伤较小。,(2)卵巢卵母细胞的活体采集主要用于非屠宰大、中动物重复进行卵母细胞的采集。包括手术法及超声波和腹腔镜引导下的卵巢卵母细胞活体采集。2.输卵管卵母细胞回收进入输卵管的卵母细胞为体内成熟的卵母细胞，回收后可直接用于进行体外受精。,3.卵母细胞形态分类采集到卵母细胞，依据其卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COC)的外形选出正常的卵母细胞并进行分类。A级：有三层以上完整而致密的卵丘细胞包绕的卵母细胞；B级：卵丘细胞三层以下，部分脱落的卵母细胞；C级：卵丘细胞扩展而松散；D级：卵丘细胞全部脱落的裸卵。A级和B级卵母细胞可用于成熟培养。,(二)卵母细胞体外成熟培养体外受精研究中，获取成熟卵母细胞主要通过以下两条途径：体内成熟，经超排处理后，采取成熟卵泡内的卵母细胞或从输卵管内回收刚刚排出的卵母细胞；体外成熟，采集卵泡中未成熟的卵母细胞，经体外培养使之成熟。后一种方法可以充分利用母畜的卵巢，是解决卵子来源最有效的途径，具有更大的实用价值。,1.卵母细胞成熟的特征卵母细胞成熟是指充分生长卵母细胞向成熟卵母细胞转化的过程。卵母细胞体外成熟主要包括减数分裂的恢复和完成，以及细胞质、细胞膜、透明带、卵丘细胞的成熟变化。第一极体排出标志着卵母细胞已达到核成熟。排卵后，卵母细胞核的发育似乎出现短暂停滞状态，并因受精而激活，也可因某些物理、化学、生物因素而激活，完成第二次减数分裂，放出第二极体，成为成熟卵子。,2.卵母细胞体外成熟培养方法(1)卵母细胞成熟培养前的准备卵母细胞成熟培养前主要准备培养液，用于家畜卵母细胞体外成熟的基础培养液很多，近年来，越来越多的研究者使用了合成培养液(如TCM-199,Hams F10和Hams F12),而以 TCM-199的报道最多。牛、绵羊和猪的卵母细胞应用这种培养液体外成熟率达到80%以上。在基础培养液中添加胎犊血清FCS和NCS比添加BSA可获得更高的成熟率，近期研究资料表明，以添加发情牛血清（estrus cow serum,ECS）或发情山羊血清(estrus goat serum,EGS)代替FCS或NCS可获得较高的成熟率。血清不仅能促进卵母细胞成熟，而且与成熟后的受精率和其后的发育率有关。,在基础培养液中添加促性腺激素，对家畜卵母细胞体外成熟亦具有十分重要的作用。常用于体外成熟的促性腺激素有hCG或PMSG，也有用LH+FSH者。促性腺激素能诱发卵丘细胞扩展，增加达到M期的比率，并有促进卵裂的作用。雌激素对家畜卵母细胞体外成熟的影响，尚存在分歧。许多学者认为雌二醇对卵母细胞完全成熟是有益的，还能有效地提高受精后胚胎的发育率。但在添加ECS或EGS的情况下，雌激素对牛卵母细胞体外成熟和胚胎发育并不重要。近期试验表明，以添加ECS或EGS取代促性腺激素和雌激素，同样可使牛卵母细胞成熟率达到90%以上，因而可以采用无激素培养法。,(2)卵母细胞的培养牛卵母细胞成熟培养液为含10%FCS或ECS，10IU/ml PMSG和10IU/ml hCG的TCM199(Earles盐液)；山羊卵母细胞成熟培养液为含10%FCS，20g/ml hCG,120g/ml 17-E2的TCM199(Hepes缓冲)；绵羊卵母细胞成熟培养液为含10%FCS的TCM199(Hepes缓冲)；猪卵母细胞成熟培养液为含10%FCS的TCM199(Earles盐液)，并添加激素及生长因子等。卵母细胞成熟培养时，在培养皿底部制作0.050.2 mL培养液微滴，上面覆盖用5%CO2 95%空气充分饱和的灭菌石蜡油，每个培养皿可作16微滴。选取A，B级卵母细胞，用成熟培养液洗涤23次，然后于每一微滴中移入1015个卵母细胞，在5%CO2、饱和湿度条件下培养。培养温度和时间因畜种不同而异，黄牛、奶牛为39为宜，水牛为37，绵羊和山羊为3739，猪为39。牛、绵羊和山羊的培养时间以2426h为宜，猪则以4248h为宜。,3.影响卵母细胞体外成熟的因素(1)动物种类(2)卵母细胞供体母畜年龄及性机能和卵巢状态(3)卵母细胞类型(4)卵巢运输、取卵方式和季节(5)培养系统(三)精子体外获能1.精子体外获能的主要途径,主要有高离子强度处理法、高pH处理法、IA(ionophore A23187)处理法、肝素处理法、咖啡因处理法以及添加牛卵泡液、猪卵泡液、子宫液、输卵管液等。2.获能精子的特征及检测(1)获能精子的特征获能精子在代谢、运动方式和顶体形态上均发生一系列明显的变化，基本上与精子体内获能相似。(2)获能精子的检测1)运动方式的测定 吸取5l获能的浮游精子，滴到载玻片上，盖以盖玻片，周围滴液体石蜡以防干固，置暗视野显微镜下观察精子的活力、运动类型和运动速度，以判断体外获能效率。,2)顶体反应的检测 伴随着精子获能，可以诱发顶体反应，这是精子入卵不可缺少的变化，观察顶体反应是判断精子获能的有效方法之一。用电镜技术观察精子的超微结构，如果精子头部质膜与顶体外膜泡状化，或仅残存顶体内膜，就能准确地判断精子发生了顶体反应，但电镜技木制片繁琐，成本也高，一般实验室尚难实施。另一种顶体反应的检测方法是采用顶体三重染色技术(triple-stain technique,TST)在光镜下观察进行鉴别。将精液用培养液或稀释液，以1 2001 500 g离心5 min,洗涤3次；将精子悬浮与等量1台盼兰混和，在离心管中于38培养10 min，600g离心7 min，弃上清液，然后将精子重新悬浮于稀释液中，反复洗涤两次，直到上清液清亮或呈谈兰色为止；将精子滴于玻片上，涂片，风干，将用1 mol/l二甲胂酸盐缓冲液(pH7.4)配制的3%戊二醛溶液滴于玻片固定精子30min,然后用无离子水洗洗两次；以0.8%的碱性棕Y水溶液染色5min,水洗；再以用1mol/lTris缓冲液(pH 5.3)配制的0.8%孟加拉玫瑰红染色 12 min,水洗；用酒精系列脱水、二甲苯透明，中性树脂封片；以1500镜检。,TST可将精子顶体帽和顶体后区染成不同的颜色,当顶体后区呈兰黑色时，说明该精子在染色前已经死亡；顶体后区呈棕色时，说明该精子在染色前是活精子；顶体帽呈品红色时，说明从未发生过顶体反应；顶体帽呈白色者，说明精子发生过顶体反应。TST法虽然可以准确地将真假顶体反应的精子区分开来，也无需昂贵的设备，但其不足之处在于有可能将一部分固定染色前已死亡的真顶体反应精子误判为假顶体反应精子。一般检测只在试验精子获能方法时应用，一旦方法成熟，应用即可，不再进行检测。,(四)体外受精受精操作时，将经获能处理的精子悬浮液5l置于塑料培养皿或多孔培养板，将灭菌石蜡油慢慢注入培养皿，再将95l精子悬浮液注入小滴，制成0.1mL的球状液滴，将外形正常且卵丘细胞明显扩展的体外培养成熟或回收的体内成熟卵母细胞，以1015枚为一组缓缓移入精子悬浮液滴中，置CO2培养箱培养使精、卵完成体外受精。(五)显微受精1.显微受精操作 显微受精是借助于显微操作的体外受精，分为ICSI和SUZI两类。,2.影响显微受精的因素影响显微受精的因素很多，其中主要有精子注入到卵母细胞的注射部位，精子的状态，精子发生，卵子状态，显微受精卵的激活和显徽操作环境条件等。三、早期胚胎代谢及体外培养（一）胚胎体外发育阻断 胚胎发生体外发育阻断的细胞阶段与胚胎基因组活化时间有关，即卵源性基因控制向胚源性基因控制转换的阶段。,（二）简单化学限定培养系统简单化学限定培养液是指用无机物和有机物，按一定要求配制而成，并在使用时添加一定比例的蛋白类物质、氨基酸和抗生素而组成的动物早期胚胎体外培养液。1.培养方法2.营养物质对早期胚胎体外发育的影响3.培养环境对早期胚胎体外发育的影响1)培养液的体积2)培养液渗透压3)氧气含量变化4)水5)培养液中的缓冲成分6)培养液中过氧化物对胚胎发育的影响7)培养液中胚胎数的影响,(三)共同培养系统共同培养系统是将胚胎与其它组织细胞(体细胞)共同培养，组织细胞产生的物质供胚胎发育所需，从而有利于胚胎克服体外发育阻断，改善胚胎发育。1.胚胎与体细胞共培养的方法1)输卵管器官培养和离体输卵管共培养2)胚胎与体细胞单层共培养先用培养液培养体细胞，形成贴壁细胞单层后与胚胎共培养。目前所用的细胞类型有：输卵管上皮细胞(oviduct epithelial cells)、子宫内膜上皮细胞(endometrical epithelial cells)、卵泡颗粒细胞(granulosa cells)、卵丘细胞(cumulus)、胚泡滋养层囊泡(trophoblastic vesicles)、成纤维细胞(fibroblasts)、羊膜囊细胞(amniotic sac cells)、禽卵黄膜腔(birds vitelline cavity)和肾细胞(nephric cells)等。,3)用体细胞培养制备的条件培养液培养胚胎先用培养液培养体细胞，隔一定时间收集培养液，离心后的上清液即为条件培养液(condition medium,CM),然后用条件培养液培养胚胎。2.体细胞共同培养系统对胚胎发育的作用共同培养系统中的体细胞叫援助细胞(helper cell)或饲养细胞(feeder cell)。体细胞共培养系统对胚胎发育的作用主要可能有以下几个方面。1)援助细胞产生促有丝分裂因子2)援助细胞产生促胚胎分化因子3)援助细胞可脱去培养液中胚胎毒性的物质的毒性,(四)含有肽类生长因子的培养系统特殊的生长因子可能对附植前胚胎发育起作用。用反转录酶-聚合酶链式反应(reverse-transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测胚胎中的mRNAs发现，生长因子或细胞分裂素和/或其受体存在于输卵管、子宫和胚胎。,分子生物学研究也证明大量生长因子存在于胚胎或胚胎周围。生长因子对培养胚胎的作用极为重要的发现就是这些生长因子在妊娠的最初几天在生殖道组织中的表达和其相应受体存在于附植前胚胎中，表明生殖道与胚胎之间的关系事实上是母体组织作用于胚胎。另一方面，在胚胎中存在生长因子和它们的受体mRNAs，表明存在一种胚胎内的生长因子循环，从而使它们在胚胎内运转以协调滋养层和内细胞团之间的对话。可见，肽类生长因子在附植前胚胎发育中可能起重要作用。目前认为对早期胚胎发育有影响的肽类生长因子主要有：,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)类胰岛素生长因子-(insulin-like growth factor-,IGF-)、IGF-、集群刺激因子-1(clony stimulating factor-1,CSF-1)白血病抑制因子(leukemia inhibitory factoe,LIF)转移生长因子-(transforming growth factor-Alpha,TGF-)血小板衍生生长因子(piatelet-derived groth factor,PDGF)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。,1978年7月25日，世界上第一个试管婴儿路易丝布朗在英国的奥尔德海姆出生了。,三胞胎试管婴儿在余杭诞生 2005年04月20日 浙江在线新闻网站,英电视台曝秘闻 杰克逊幼子竟是试管婴儿？(图)http:/2003年02月06日09:27 信息时报,