rhorock通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制.ppt

RHO/ROCK通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制,研究方向：神经损伤与修复 专业：神经外科研究类别：基础研究 项目来源：国家自然科学基金项目导师：段虎斌 学生：崔刚,主要内容,立论依据研究目标、内容、方法拟解决关键问题、可行性分析创新点研究进度、预期成果经费预算、参考文献,立论依据,创伤性脑损伤（TBI）致死、致残率很高，给社会家庭造成巨大损失。在美国每年约有1，700，000人遭受TBI，其中约52，000人死亡，直接和间接经济损失达600亿美元。我国每年约有10万人死于TBI，其中，因车祸死亡约5万人，这一数字也呈上升趋势。,立论依据,本课题为国家自然基金项目-“创伤性脑损伤的神经源性机制及其干预实验研究”的后续研究，着重讨论Rho/Rock通路在TBI后神经源性炎症和神经再生修复中的作用机制,探索新的干预措施，从新角度探求脑创伤后神经修复的新治疗策略和方案。,立论依据,本研究采用TBI大鼠模型，以脑组织内NF-B等为神经源性炎症反应的指标，脑细胞线粒体、神经突触等超微结构变化为神经病理损伤指标，Nogo-A等为阻碍神经再生的指标，BDNF等为促进神经再生的指标，探究该通路在调控神经再生中的作用机制,立论依据,机制假设：TBI激发神经源性炎症，激活Rho/Rock通路，致球蛋白轻链磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起脑血管平滑肌收缩，血流下降，内皮及屏障功能受损，导致脑组织缺血，阻碍神经再生，脑血管周围炎性物质渗出增加，引发血管性、细胞性脑水肿和脑细胞调亡。使用Rho激酶、NF-B抑制剂和神经营养因子等干预措施，松弛血管平滑肌，扩张血管，促进脑组织血供，改善神经再生微环境,这为TBI的早期干预和康复治疗提供了新思路。,图1 Rho/Rock经典信号通路,Rho/Rock信号通路的成分主要有三个：小G蛋白(在这里主要是指Rho)、与Rho相连的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效应分子3-5。,研究目标,（1）探讨Rho/ROCK信号通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制；（2）研究Rho/ROCK信号通路在控TBI后中枢神经系统修复微环境的作用及其机制；（3）观察多种干预措施对Rho/ROCK信号通路的影响及其在治疗TBI中的应用价值。,（1）通过免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据；（2）通过分子生物学手段（如PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等的基因表达水平。（3）取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。（4）观察干预措施（Rho激酶抑制剂）对上述（1）（3）变化的影响；（5）上述几项中改变和变化的相关性分析。,研究内容,（1）未干预TBI组：实验采用SD大白鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重270-290g，乌拉坦腹腔注射（1.2mgkg-1）麻醉满意后，将大鼠固定在脑立体定位仪上（ST-T型，日本成贸公司）。制作TBI模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜,切口长2cm，暴露右顶骨，牙科台式电钻(宁波医疗器械厂)于冠状缝后1.5mm,中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整，将撞杆头端置骨窗处,击锤（重20g）沿外周导管分别从10cm、30cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶轻、中度脑挫伤,另用击锤（重40g）沿外周导管从25cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶重度脑挫伤,致伤冲击力分别为0.028Ns、0.048 Ns和0.088 Ns，硬膜保持完整，骨蜡封闭骨窗。TBI组按损伤程度分为轻、中、重三组。于伤后0.5、6、12、24、48、72h断头取血，开颅取脑，进行如下实验：,实验方法,免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据；通过分子生物学手段（PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A、等的基因表达水平；取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。,实验方法,（2）干预TBI组：撞击鼠脑后使用Rho激酶抑制剂（Hydrochloride Fasudil、Y-30141）、NF-KB抑制剂-PDTC、神经营养因子等对TBI组上述3项改变的影响。各种干预措施（如 Rho激酶抑制剂-Y-30141、NF-KB抑制剂）对神经损伤修复的影响（3）统计学分析 上述各项中改变和变化的相关性分析。,实验方法,技术路线图,拟解决的关键问题（1）大鼠大脑中动脉的分离，需要显微镜下仔细操作，技术要求高，我科实验室有实验用手术显微镜并有老师指导，仍需要不断练习，提高显微操作技能。（2）各种干预措施（如 Rho激酶抑制剂-Y-30141、NF-KB抑制剂）对神经损伤修复的影响，国内外前期研究少，需要不断摸索实验条件。,4-氨基吡啶类（Y-30141）,异喹啉类（H-1152P）,（1）项目的设计构思是建立在以往工作基础上，是国家自然基金的后续深入研究，现已建立了稳定的实验动物模型和实验方法，并且已开展有关方面的研究，得到初步结果；（有前期研究基础）（2）本项目采用成熟的动物模型，成熟的分子生物学、放射免疫学、病理学技术；（在方法学方面是可行的）（3）本人的指导老师和项目组成员有长期科研实践经验，为本课题提供技术和理论指导；（4）项目申请人所在学科有专用实验室，所在实验室和所在单位拥有课题相关的实验设备，导师课题经费充足，实验动物及相关试剂均可购买到。（实验条件具备，可以确保实验如期完成）,可行性分析,（1）关于Rho/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制目前尚未见相关文献报道。（2）关于Rho/ROCK信号转导通路在调控TBI后神经再生和功能修复微环境中的作用机制，目前尚未见相关文献报道。（3）关于多种干预方法（Rho激酶抑制剂、NF-KB抑制剂、NPY-受体阻抑、NK1-受体阻抑、干细胞细胞移植等）在颅脑损伤期对Rho/ROCK信号转导通路的影响机制，尚未见相关文献报道。,创新点,（1）2015年01月份2015年4月份：完成假手术组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。（2）2015年5月份2015年8月份：完成颅脑损伤未干预组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。（3）2015 年9月份2015年12月份：完成颅脑损伤干预组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。（4）2016 年1月份2015年3月份：建立实验数据库，统计分析实验数据，总结课题，撰写论文，发表有关论文，准备论文交流与答辩。,研究进度,（1）Rho/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症中发挥重要作用，脑血管Rho激酶含量与脑组织NF-B表达水平之间存在相关性；（2）Rho/ROCK信号转导通路在调控TBI后神经再生和功能修复微环境中发挥枢纽作用，脑血管Rho激酶与促进和抑制神经再生的因子（如神经营养因子和NOGO-A）之间存在相关性；（3）Rho激酶抑制剂通过干预Rho/ROCK信号转导通路，对减轻TBI的严重程度、促进神经再生和功能恢复方面能起一定作用，为临床治疗TBI提供新思路和新方法。（4）成果以论文形式发表,预期成果,经费预算,参考文献：,参考文献：,1.Traumatic Brain Injury in the United States:Emergency Department Visits,Hospitalizations,and Deaths,2002-2006.http:/www.cdc.gov/TraumaticBrainInjury/index.html2.王忠诚.神经外科学.湖北：湖北科学技术出版社，2005.3653.Fujimura M,Usuki F,Kawamura M.Inhibition of the Rho/ROCK pathway prevents neuronal degeneration in vitro and in vivo following methylmercury exposure.Toxicol Appl Pharmacol.2011,250(1):1-9.4.Cheng R,Shao MY,Yang H.The effect of lysophosphatidic acid and Rho-associated kinase patterning on adhesion of dental pulp cells.Int Endod J.2011,44(1):2-8.5.Haydont V,Bourgier C,Vozenin-Brotons MC.Rho/ROCK pathway as a molecular target for modulation of intestinal radiation-induced toxicity.Br J Radiol.2007,80(1):S32-40.6.Zhou Q,Gensch C,Liao JK.Rho-associated coiled-coil-forming kinases(ROCKs):potential targets for the treatment of atherosclerosis and vascular disease.Trends Pharmacol Sci.2011,32(3):167-173.7.Hall A,Lalli G.Rho and Ras GTPases in axon growth,guidance,and branching.Cold Spring Harb Perspect Biol.2010，2(2):a001818.8.Bryan BA,Dennstedt E,Mitchell DC.RhoA/ROCK signaling is essential for multiple aspects of VEGF-mediated angiogenesis.FASEB J.2010,24(9):3186-3195.9.Hu E,Lee D.Rho kinase as potential therapeutic target for cardiovascular diseases:opportunities and challenges.Expert Opin Ther Targets.2005，9(4):715-736.10.Cheng HL,Su SJ,Huang LW.Arecoline induces HA22T/VGH hepatoma cells to undergo anoikis-involvement of STAT3 and RhoA activation.Mol Cancer.2010,9:126.11.Goupil E,Tassy D,Bourguet C,.A novel biased allosteric compound inhibitor of parturition selectively impedes the prostaglandin F2alpha-mediated Rho/ROCK signaling pathway.J Biol Chem.2010,285(33):25624-25636.12.Monceau V,Pasinetti N,Schupp C.Modulation of the Rho/ROCK pathway in heart and lung after thorax irradiation reveals targets to improve normal tissue toxicity.Curr Drug Targets.2010,11(11):1395-1404.13.Kogata N,Tribe RM,Fssler R.Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction.Genes Dev.2009,23(19):2278-2283.14.Tanimori Y,Tsubaki M,Yamazoe Y.Nitrogen-containing bisphosphonate,YM529/ONO-5920,inhibits tumor metastasis in mouse melanoma through suppression of the Rho/ROCK pathway.Clin Exp Metastasis.2010 Oct;27(7):529-538.,欢迎各位老师提出宝贵意见,谢谢！,答辩项目背景材料,Rho蛋白,Rho蛋白:Rho蛋白是G蛋白中的一种，是属于小G蛋白超家族成员，其分子量约2030Kd，由氨基酸序列高度同源3种异构体组成：RhoA、RhoB、RhoC。,Rho蛋白的两种形式转化机制,Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的RhoGDP形式两种状态存在于细胞质中、质膜上6-8。,ROCK的一级功能结构A、晶体结构B、整体结构C示意图,Rhokinase(ROCK):ROCK，即Rho激酶，属于丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，以两种同源性极高的异构体存在：ROCK II(ROCK)和ROCK I(ROCK)。Rho激酶包括一个催化区(位于分子结构的N端)，一个螺旋区(位于分子结构的中间部分)及一个pleckstrin同源区(PH区，位于分子结构的C 端)。Rho激酶的Rho结合区(Rhobinding，RB)位于螺旋区的C端。RhoGTP与螺旋区的C端相互作用，并激活Rho激酶的磷酸转移酶活性。Rho激酶的C端(包括RB和PH区)为激酶的负向调节区。在静息状态下，RB和PH区与激酶的催化区相互作用，并抑制激酶的活性。激活状态的Rho与RB相互作用，改变了Rho激酶的构型，从而解除RB和PH对激酶的抑制，Rho激酶被激活。激酶缺失C端区，包括PH区或PH与螺旋区，可使激酶持续激活。某些化学制剂，如Y-227632、HAl077(fasudil)或hydroxyfasudil等，能够以与ATP竞争的方式特异性地抑制Rho激酶的活性。它们与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，从而抑制Rho激酶的活性9-11。,ROCK活性的调节,Rho-kinase的效应分子:当Rho蛋白被激活，就转移到特定的细胞亚结构上，它们将与下游效应分子交互作用，激发特定的信号级联。至今，有70多个蛋白被鉴定属于Rho蛋白的下游效应分子。Rho激酶的下游底物虽然很多，但是被深入研究的并不是很多。其中球蛋白轻链磷酸化酶(myosin lightchain phosphase，MLCP)是目前研究得最多也是最清楚的Rho激酶作用的底物之一。MLCP的肌球蛋白结合亚基(myosinbinding subunit，MBS)是第一个被确认的Rho激酶的底物。MLCP包括3个亚基：MBS，37kDa的l型磷酸化酶催化亚基、肌球蛋白结合亚基(MBSl 30k)即磷酸酶靶蛋白I(MYPT-1)调节亚基和一个功能不明的小M20非催化亚基。MLCP通过MBS与磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)结合，并使其脱磷酸。Rho激酶激活后可磷酸化MBS，从而导致MLCP失活。Rho激酶还可以直接磷酸化MLC。,Rho激酶活化的病理过程,所以，Rho激酶可通过直接磷酸化MLC及使MLCP失活两种途径调节MLC的磷酸化水平。Rho激酶激活后MLCP的活性受到抑制，导致MLC磷酸化水平升高和平滑肌细胞收缩，内皮细胞收缩，还有一个Rho激酶的作用底物研究也较多：内皮源性一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)。目前研究认为组织缺血等可使Rho激酶活化，使eNOS下调，引起血管收缩，血流下降，内皮功能及屏障受损12-15。,TBI后RhoRock信号转导通路如何被激活并在神经源性炎症及神经再生修复中发挥作用的呢？,我们认为，RhoRock信号转导通路的激活是一个级联反应过程。在静息状态下，Rho激酶的Rho结合结构域和PH结构域与Rho激酶的催化结构域相互作用，从而抑制了激酶的活性。Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式两种状态存在于细胞质中、质膜上。当TBI时，机械能刺激、氧自由基、神经源性炎症中的致炎物质、细胞因子等作用于细胞膜上G蛋白偶联受体，进而Rho被活化后，并发生膜转位：即从胞浆中游离的GDP 结合的失活状态转变为GTP结合的活化状态并结合至细胞膜内侧面的受体区域，活化的Rho将信号传递给Rock，Rock接受活化信号后，其分子中的854位丝氨酸和697位苏氨酸磷酸化而激活，活化的Rho激酶一方面失活LIM激酶介导的confilin(一种分割肌动蛋白的蛋白质)而调制肌动蛋白细胞骨架。另一方面Rho通过Rho激酶与MBS结合使其磷酸化，从而抑制MLC磷酸脂酶的活性。失活的肌球蛋白磷酸酶不能将MLC脱磷酸化，使得细胞浆内磷酸化MLC水平上升，MLC的磷酸化能诱导II 型肌球蛋白构象变化，使其与肌动蛋白的相互作用增加，肌动肌球蛋白交联增加，从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，细胞发生收缩。MLC磷酸化水平在平滑肌细胞中直接决定着细胞的收缩功能，而在非平滑肌细胞中则控制肌动蛋白微丝骨架的聚合动力学。细胞的移动、趋化、黏附与收缩都是通过微丝骨架的聚合与延伸来实现的。于是RhoRock 信号通路就是通过这样一个复杂的磷酸化脱磷酸化级联反应来调节微丝骨架的聚合，控制细胞的多种生物学行为信息转导、细胞的生长、分化、迁移以及炎性细胞的黏附、吞噬等。若RhoRock 信号通路激活发生在TBI后的脑血管上，一方面可引起血管内皮细胞（EC）收缩，细胞间距增大，EC屏障功能受损,从而使血管通透性增加，使大量富含蛋白质的液体及炎性介质渗入组织间隙，造成脑水肿；另一方面，也会导致血管平滑肌（VSM）细胞的舒张功能障碍，引起损伤区及其周边脑血管收缩，血供减少，进一步引起邻近脑组织缺血缺氧，加重脑水肿，导致颅压增高，甚至脑疝死亡。,Rho/Rock信号通路不仅在TBI后神经源性炎症中起着中心枢纽作用，而且在TBI后的脑神经元和神经网络修复方面也扮演着重要的角色。,许多国内外研究表明，中枢神经系统微环境是影响中枢神经功能恢复的主要因素16-20，干细胞治疗脑损伤也需要在良好的微环境中才有可能获得良好的效果。脑损伤后，在损伤部位及其周围炎性细胞的浸润和胶质细胞的反应性增生导致胶质瘢痕的形成，是影响干细胞替代原有脑神经元发挥相应功能的主要障碍，甚至还可能引起癫痫发作等异常脑电活动疾病。我们知道，脑损伤后中枢神经系统微环境中阻碍神经元树突轴突再生的分子包括：硫酸软骨素（来自于胶质瘢痕中反应性增生的胶质细胞）、少突胶质细胞分泌的髓磷脂和髓鞘的残片、髓鞘相关性糖蛋白（MAG）、神经突生长抑制因子（Nogo-A）、少突胶质细胞蛋白多糖（Omgp）、ephrin B3、Sema4D等21-23（见图7）。促进神经元树突轴突再生的分子包括：神经营养因子（NGF）、睫状神经营养因子（CNTF）、胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、白血病抑制因子（LIF）、胰岛素样生长因子（IGF-）、转化生长因子（TGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源生长因子（PDGF）等，其中神经营养因子又包括：神经生长因子（NGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养因子 3（NT-3）、神经 营养因子4/5（NT-4/5）等24-26。,上述起阻碍和促进神经元树突轴突再生的两类分子如何发挥作用，调控自身神经元、移植神经干细胞和神经网络的修复进程？我们认为，Rho/Rock信号通路在调控脑损伤后中枢神经系统微环境阻碍和促进神经元树突轴突再生的两类分子表达及数量增减中起着关键作用。由于Rho/Rock信号转导通路在TBI后神经源性炎症中起着中心枢纽作用，而炎症反应对中枢神经系统创伤修复的微环境起着主导作用，因此该通路对脑损伤后中枢神经系统修复的微环境势必产生影响，进而影响到TBI后脑神经元和神经网络修复。研究Rho/Rock信号通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制，对如何控制脑损伤后炎症反应对脑神经元和神经网络修复的影响、如何创造一个良好的神经再生的微环境、如何早期干预，最大限度地尽早修复受损的脑神经元和重建正常的中枢神经网络有重要意义。,我们对TBI后引起的脑损伤过程及其创伤修复机理进行探讨研究，提出以下假设：,TBI后，机械能刺激、神经源性炎性物质、氧自由基等激活Rho/Rock信号通路，致球蛋白轻链磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起脑血管平滑肌收缩，血流下降，内皮及屏障功能受损，导致脑组织缺血，阻碍神经再生，脑血管周围炎性物质渗出增加，引发血管性、细胞性脑水肿和脑细胞调亡。使用Rho激酶抑制剂（如Hydrochloride Fasudil27，Y-2763228等）、NF-B抑制剂（如pyrrolidinedithiocarbarnate，PDTC 29-30等）和神经营养因子（如NGF、BDNF、NT-3）等干预措施，松弛血管平滑肌，扩张血管，促进脑组织血供，改善神经再生微环境。这为TBI的早期干预和康复治疗提供了新思路。,本人及其研究成员正在进行的该方面预实验，并已有前期工作基础，我们研究了TBI时脑组织不同部位NF-B含量及表达情况，结果显示，TBI后损伤处周边脑细胞中NF-B基因表达水平、神经突生长抑制因子Nogo-A实验组明显较对照组增加。同时发现实验组下丘脑间质疏松，部分神经元树突不清，细胞核浆界限模糊，着色较深呈毛玻璃样，部分神经元红色变性，细胞周围有空晕现象，并可见少量小胶质细胞吞噬神经元现象（嗜神经现象），以及毛细血管周围间隙开放。这说明TBI后发生了神经源性炎症，致脑细胞NF-B等炎性物质表达增强，Nogo-A表达增加，激发了Rho/Rock信号通路，最终引起细胞性脑水肿及血管源性脑水肿。我们将进一步研究TBI后炎性因子、缩血管物质、促凋亡因素、Rho激酶抑制剂、抗炎因子、痛觉干预、神经营养因子等对中枢神经系统微环境的影响。系统、深入研究将有助于我们更全面、确切地认识和了解Rho/Rock信号通路在TBI中的病理学作用，具有一定的学术价值和临床实用意义。,参考文献：,1.Traumatic Brain Injury in the United States:Emergency Department Visits,Hospitalizations,and Deaths,2002-2006.http:/www.cdc.gov/TraumaticBrainInjury/index.html2.王忠诚.神经外科学.湖北：湖北科学技术出版社，2005.3653.Fujimura M,Usuki F,Kawamura M.Inhibition of the Rho/ROCK pathway prevents neuronal degeneration in vitro and in vivo following methylmercury exposure.Toxicol Appl Pharmacol.2011,250(1):1-9.4.Cheng R,Shao MY,Yang H.The effect of lysophosphatidic acid and Rho-associated kinase patterning on adhesion of dental pulp cells.Int Endod J.2011,44(1):2-8.5.Haydont V,Bourgier C,Vozenin-Brotons MC.Rho/ROCK pathway as a molecular target for modulation of intestinal radiation-induced toxicity.Br J Radiol.2007,80(1):S32-40.6.Zhou Q,Gensch C,Liao JK.Rho-associated coiled-coil-forming kinases(ROCKs):potential targets for the treatment of atherosclerosis and vascular disease.Trends Pharmacol Sci.2011,32(3):167-173.7.Hall A,Lalli G.Rho and Ras GTPases in axon growth,guidance,and branching.Cold Spring Harb Perspect Biol.2010，2(2):a001818.8.Bryan BA,Dennstedt E,Mitchell DC.RhoA/ROCK signaling is essential for multiple aspects of VEGF-mediated angiogenesis.FASEB J.2010,24(9):3186-3195.9.Hu E,Lee D.Rho kinase as potential therapeutic target for cardiovascular diseases:opportunities and challenges.Expert Opin Ther Targets.2005，9(4):715-736.10.Cheng HL,Su SJ,Huang LW.Arecoline induces HA22T/VGH hepatoma cells to undergo anoikis-involvement of STAT3 and RhoA activation.Mol Cancer.2010,9:126.11.Goupil E,Tassy D,Bourguet C,.A novel biased allosteric compound inhibitor of parturition selectively impedes the prostaglandin F2alpha-mediated Rho/ROCK signaling pathway.J Biol Chem.2010,285(33):25624-25636.12.Monceau V,Pasinetti N,Schupp C.Modulation of the Rho/ROCK pathway in heart and lung after thorax irradiation reveals targets to improve normal tissue toxicity.Curr Drug Targets.2010,11(11):1395-1404.13.Kogata N,Tribe RM,Fssler R.Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction.Genes Dev.2009,23(19):2278-2283.14.Tanimori Y,Tsubaki M,Yamazoe Y.Nitrogen-containing bisphosphonate,YM529/ONO-5920,inhibits tumor metastasis in mouse melanoma through suppression of the Rho/ROCK pathway.Clin Exp Metastasis.2010 Oct;27(7):529-538.,15.Arita R,Hata Y,Ishibashi T.ROCK as a Therapeutic Target of Diabetic Retinopathy.J Ophthalmol.2010;2010:175163.16.Benson M.D.Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth.Proc.Natl Acad.Sci.2005,102:10694-10699.17.A,Heasman SJ,Wojciak-Stothard B.Microtubules regulate migratory polarity through Rho/ROCK signaling in T cells.PLoS One.2010,5(1):e8774.18.Madri JA.Modeling the neurovascular niche:implications for recovery from CNS injury.J Physiol Pharmacol.2009,60(S4):95-104.19.杨西涛,冯东福,朱志安.微血管环境影响中枢神经再生的研究进展J.中华实验外科杂志,2010,27(08):1176-1178.20.Webber C,Zochodne D.The nerve regenerative microenvironment:early behavior and partnership of axons and Schwann cells.Exp Neurol.2010,223(1):51-59.21.Liu BP,Cafferty WB,Budel SO.Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2006,361(1473):1593-1610.22.Natera-Naranjo O,Aschrafi A,Gioio AE.Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.RNA.2010,16(8):1516-1529.23.Jiang XS,Wassif CA,Backlund PS.Activation of Rho GTPases in Smith-Lemli-Opitz syndrome:pathophysiological and clinical implications.Hum Mol Genet.2010,19(7):1347-1357.24.Vodrazka P,Korostylev A,Hirschberg A.The semaphorin 4D-plexin-B signalling complex regulates dendritic and axonal complexity in developing neurons via diverse pathways.Eur J Neurosci.2009,30(7):1193-1208.25.Manni L,Albanesi M,Guaragna M.Neurotrophins and acupuncture.Auton Neurosci.2010,157(1-2):9-17.26.Muir D.The potentiation of peripheral nerve sheaths in regeneration and repair.Exp Neurol.2010,223(1):102-111.27.Li Y,Yao JH,Hu XW.Inhibition of Rho kinase by fasudil hydrochloride attenuates lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion.Life Sci.2011,88(1-2):104-109.28.Kawaguchi A,Ohmori M,Fujimura A.Partial protective effect of Y-27632,a Rho kinase inhibitor,against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats.Eur J Pharmacol.2004,493(1-3):167-171.29.Ilbey YO,Ozbek E,Simek A.Pyrrolidine dithiocarbamate treatment prevents ethylene glycol-induced urolithiasis through inhibition of NF-kappaB and p38-MAPK signaling pathways in rat kidney.Arch Ital Urol Androl.2010,82(2):87-94.30.Cotogni P,Bini R,Trombetta A.Pyrrolidine dithiocarbamate modulates HSP70,iNOS,and apoptosis during hemorrhagic shock resuscitation in rats.J Invest Surg.2010,23(6):295-302.,参考文献：,